6基因的重组与转移.pptx

;外源DNA;;;1. 两段DNA的连接;;;;二、齐平末端（blunt end）的连接;1972年，斯坦福大学的P. Labban和P. Kaiser提出。;;用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。; ;;④缺点：;（3）DNA接头 (adapter)连接法;;;;;;三、PCR产物的连接;引物1;GCTAGCCGG ;带酶切位点的PCR产物;2. 与T载体直接连接;;四、DNA体外连接应注意的事项;EcoRI;2. DNA插入的方向正确;3. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确;4. 防止载体自身环化连接;1. 载体自身环化连接（能存活）;;1. 目的;;;;4. 制备过程;二、重组DNA导入大肠杆菌;每?gDNA转化成功的细菌克隆数。 ;10ng载体DNA;;;环形重组质粒 质粒自我连接;①生长状态;把重组的噬菌体?DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的?噬菌体颗粒。;cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32℃下培养细菌时能够保持溶源性。 但当温度升高到44℃—45℃时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，?DNA复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。;;;;;转化率高的菌株； 有突变的菌株（与导入的载体基因互补）； 不育的菌株（不会与其他酵母接合）。;（1）利用原生质球进行转化 ; 酵母;;植物细胞;又称高速微型子弹射击法（High-velocity microprojectiles);农杆菌: used extensively for genetic engineering of plants. 包含Ti质粒 Tumor inducing plasmid (bacterial plasmid) T-DNA (Transferred-DNA), 可以转移进入植物基因组.;A、 Ti 质粒介导的整合转化程序;Ti Plasmid; Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，其分子量为95～156×106D, 约有200kb组成。 根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同，Ti质粒可以被分成四种类型： 章鱼碱型(octopine) 胭脂碱型(nopaline) 农杆碱型（agropine） 农杆菌素碱型（agrocinopine）或称琥珀碱型(succinamopine);a、Ti 质粒的图谱;;;T-DNA的染色体整合机制;d、Ti 质粒的改造;共整合转化程序;二元整合转化程序; B 农杆菌介导的遗传转化： 转化方法研究及宿主范围的拓展; 转化机制研究; 大片段的DNA转移; 植株原位转化（in planta transformation).;转化方法研究及宿主范围的拓展 农杆菌有严格的宿主范围，它比较易浸染双子叶植物，对单子叶??物不敏感。但近年来有一定进展，农杆菌在一定条件下同样可以感染单子叶植物。利用农杆菌介导分别从水稻、小麦、玉米、甘蔗等获得了转基因植株。下面几个因素使农杆菌介导转化单子叶植物获得进展： 使用酚类物质诱导vir基因表达。 首先发现AS（乙酰丁香酮）和HO-AS能诱导vir基因表达，后来发现邻苯二酚40多类酚类物质对virG有诱导活性。多种酚类复合物比单一酚类物质的诱导活性更高。此外，较低的pH、低于280C的温度、较高的渗透压、一些糖类等均能诱导vir基因表达。;广寄主范围农杆菌菌株的筛选。 主要是在农杆菌菌株的筛选、质粒载体的构建及菌株与载体的互作等方面进行了大量工作。 使用单子叶植物特异启动子（如Actin,Ubiquione,and α-Amylase的启动子代替35S启动子）和利用分生组织与农杆菌共培养。 目前已清楚决定农杆菌与玉米的亲和性的是农杆菌的virA基因，对该基因进行改造可望提高农杆菌对单子叶植物的亲和性。生长和分裂旺盛的胚性愈伤组织被认为是获得单子叶植物转化成功的关键因素之一。;转化机制研究;;大片段DNA的转移; 功能基因组的研究要求创造很多突变体，需要寻求简单的转基因方法。主要在拟南芥中应用，大量的植株抽真空20分钟，使细菌进入植物细胞间隙，或者将花朵抽真空让细菌进入，这种方法避免了细胞培养过程，但转化效率不高。;SAAT: sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation Transgenic Research 6, 329-336. ;Fig. 3. Cross section of control (A) and SAAT-treated (B and C) immature soybean cot