制备感受态细胞的实验报告.doc

可修改 欢迎下载 精品 Word 可修改 欢迎下载 精品 Word 可修改 欢迎下载 精品 Word 制备感受态细胞的实验报告 实验目的 掌握制备化学感受态细胞和电转化感受态细胞的方法和步骤。 实验原理 1.感受态细胞的概念 重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。 ?? ?在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。 ? ? 所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。 ??? 制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃ 在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内， 使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。 ???? 受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 化学制备法： ?? 大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42 Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100~1000倍。 化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。 物理制备法： ?? 电转法??（原理待续除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。 效价的计算公式： 实验步骤 菌种活化 菌种保存在—70度的超低温冰箱 前培养 将单菌落接种到10ml的培养液中，在恒温振荡器37°下过夜培养 培养基的制备 200ml液体培养基：加水150ml于烧杯中，加2g蛋白胨，1g酵母粉，2gNacl定容200ml在磁力搅拌器中搅拌 200ml固体培养基：在液体的基础上，加琼脂3g 在把液体与固体放到高压灭菌锅里 121℃ 20minutes 第二天接种菌液4ml到培养基中在恒温振荡箱中培养一夜 化学方法：（以大肠杆菌感受态制备为例） 1)?????测培养液（振荡了一夜的）OD600 若0.6A(在0.4~0.5之间即可) 2)??????每人取50ml 菌液到离心管 4000rpm 4℃ 10 minutes 3)?????在菌体中加20ml中加0.1mol氯化钙水溶液（目的：将细菌彻底悬浮分散开来）然后冰浴30min 离心 4）倒上清液，加10ml 0.1 mol 氯化钙(10%的甘油)悬浮后离心 5）在收集菌体 加150ml 0.1mol氯化钙悬浮 6）分装（40ml每管）液态冷冻 电?转化 1)????接种：在200ml的LB液体培养基加入1ml的前培养?? 2)培养：OD值在?0.4~0.5之间即可 离心后 将已培养好的放到冰里摇晃??? 3)?水洗1 加水30~40ml 悬浮 离心 水倒掉 水洗2 加20ml水???? 离心 水倒掉 水洗3 加10ml水 离心 水倒掉 4)?????甘油10%洗2次（每次加5ml）中间离心两次 在第二次加甘油悬浮后离心后加120uLGYT悬浮液 5)?????? 一个人准备4个小管子（每个40uL 扔到液氮速冻 放到-70℃ 效价检测：根据加入2uL的菌体液体培养出的菌落数若为N个，则计算效价X的公式推导为N/X=1000/10^10则x=N*10^7 效价：指能用1ug的标准质粒能够转化出的菌落数。 具体步骤 化学效价检测 A.把感受细胞从超低温冰箱中拿出(冰水先准备好再拿出感受态细胞在冰水中慢