手足口病的实验诊断.pptx

手足口病的实验诊断;手足口病的病原;Courtesy of Linda M. Stannard, University of Cape Town, S.A.h;人肠道病毒发现的历史;肠道病毒主要血清型;手足口病的常见致病病原;肠道病毒的抵抗力;（一）粪便标本 采集病人发病7日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量5～8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。 （二）脑脊液标本 出现神经系统症状的病例，要采集脑脊液标本，进行病原和抗体检测。采集时间为出现神经系统症状后3日内，采集量为1.0～2.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。;手足口病的标本采集; （五）疱疹液 可同时采集多个疱疹作为一份标本，用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3～5ml保存液（维持液或生理盐水）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。所采集标本4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。;标本采集器械要求;鼻咽拭子保存管：10 ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存） 痰液保存管：50 ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存） 尸检组织冻存管：50ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)；尸检（每一个样品换手术刀） 记号笔：油性，防水; 在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液或脑脊液 中分离病毒具有很高的诊断价值。 用于采集咽拭子的无菌拭子要放在适当的保存液中，如维持液或生理盐水，以防干燥。;标本采集注意事项;手足口病的诊断一般是通过采集适当的临床标本后进行基因检测、抗原检测、血清学抗体检测、病毒分离和病鉴定;手足口病的实验室诊断方法;;病毒分离培养;病毒分离培养;病毒分离培养;血清抗体检测;病毒核酸检测—RT-PCR;病毒核酸检测—RT-PCR; 粪便标本：采用氯仿进行处理。 肛拭子/咽拭子标本：咽拭子要在标本保存液中充分搅动，然后在4℃下，10000 rpm离心20min 。 疱疹液和脑脊液：直接用于RNA提取。;可使用商业化试剂盒从临床标本中提取病毒RNA 简化操作、规范方法、条件一致、排除干扰 QIAGEN Viral RNA Mini Extraction Kit（CAT：52904）适合临床标本和病毒培养物标本 QIAGEN Rneasy Mini Kit（CAT： 74104） 适合组织和咽拭子标本;引 物;EV71核酸检测引物序列： EV71-S（上游）：5`- GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC -3` EV71-A（下游）：5`- ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC -3`;CA16核酸检测引物序列： Cox A16-S（上游）：5`-ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC-3` Cox A16-A（下游）；5`-TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG-3` ;根据自己实验室的实际情况建立各自RT-PCR反应体系 配下列试剂主溶液： 10×PCR Buffer（含Mg2+）·················································5.0μl dNTPs（2.5mM each）······················································· 2.0μl 上游引物（0.1μg/μl）························································1.0μl 下游引物（0.1μg/μl）························································1.0μl RNA酶抑制剂（RNasin,40U/μl）······································ 0.5μl Taq DNA聚合酶（5U/μl）················································· 0.5μl AMV逆转录酶（10U/μl）·················································· 1.0μl 模板RNA···································································