明胶微生物限度检查法方法学验证.docx

PAGE PAGE # 明胶微生物限度检查法方法学验证 1样品： 明胶，批号20110114规格：药用辅料；生产厂家：**** 胶业有限公司。 2验证用菌种 枯草杆菌 CMCC 63202-4a; 金黄色葡萄球菌CMCC 26003-28 ； 大肠埃希菌CMCC 44102-22； 白色念珠菌CMCC (F) 98001; 黑曲霉 CMCC (F) 98003。 3 培养基 营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、真菌琼脂培养基、改良马丁培养基、胆盐 乳糖培养基(BL)、营养肉汤培养基、真菌培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基和 甘露醇氯化钠琼脂培养基均由中国药品生物制品检定所生产，按使用说明书配制。 4设备 序号 设备型号 备注 数显恒温水浴锅 HH-6 国华电器有限公司 电子天平 FA2004 上海良平仪器仪表有限公司 雷磁PH计 PHS-3C 上海精密科学仪器有限公司 电热恒温培养箱 DHP-9052 上海一恒科技有限公司 上海一恒科学仪器有限公司 电热鼓风干燥箱 101-3 上海阳光实验仪器有限公司 隔水式恒温培养箱 GHP-9160 上海一恒科技有限公司 上海一恒科学仪器有限公司 不锈钢立式电热蒸汽 消毒器 YM50 上海三申医疗器械有限公司 净化工作台 吴江市绿叶空调净化有限公司 生物显微镜 XSP-00 江西枫林光学仪器有限公司 5 方法 参照中国药典 2010 年版有关微生物限度检查法方法学验证试验。 6 操作方法 6.1 常规法——细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证 6.1.1 菌液制备 分别接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培 养基中，经30~35C培养18~24小时后，分别取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆 菌的肉汤培养物1ml+9ml0.9%无菌氯化钠溶液，10倍稀释至10-6~10-7 ,细菌数约为 50~100cfu∕ml ,做活菌计数备用。 接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，经 23~28 C培养24~48小时 后，取白色念珠菌液体培养物 1ml+9ml 0.9%无菌氯化钠溶液， 10倍稀释至 10-4~10-7， 菌数约为50~100cfu∕ml ,做活菌计数备用。 接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中， 经23~28C培养5~7天后， 取黑曲霉斜面培养物，加 3~5ml0.9%无菌氯化钠溶液将抱子洗脱，吸出抱子悬液 Iml +9ml0.9%无菌氯化钠溶液，10倍稀释至10-4,菌数约为50~100cfu∕ml,做活菌计数备用。 供试液制备 取供试品10g,加pH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液至100mL,振摇混匀，制成1 : 10 供试液； 回收率测定（平皿计数法） 试验组 取1 : 10供试液1 mL、50~100个/ mL试验菌液1 mL同时加入平皿中，立即倾注 15-20 mL温度不超过45C的培养基中，待凝固后，置培养观察结果，同时平行 3个平 皿。 菌液组 50~100个/ mL的试验菌各1 mL分别加入至平皿中，立即倾注 15-20 mL温度不 超过45C的培养基，待凝固后，置培养观察结果，每个菌株平行 3个平皿。 供试品对照 取1 : 10供试液各1 mL分别加入至平皿中，立即倾注15-20 mL温度不超过45C 的培养基，待凝固后，置培养观察结果。 6.134稀释剂对照 取稀释液ImL替代供试品，加入50~100个试验菌，按试验组的供试液制备方法和 菌落计数方法测定其菌数。 以上试验均独立平行进行3次 6.1.4试验结果 试验组的菌回收率（%）=［（试验组平均菌落数一供试品对照组平均菌落数）/菌液 组平均菌落数］］× 100% 稀释剂对照组的菌回收率（% =［（稀释剂对照组的平均菌落数/菌液组的平均菌 落数）］× 100% 胶囊用明胶3次独立平行常规平皿培养法微生物限度检查的验证结果见表 1。 表1验证试验结果（常规法） （1: 10） 单位（cfu/mL） 菌株 菌种 代数 试验 次数 菌液组 稀释剂本 底菌数 样品本底 菌数 稀释 剂试 验组 试验 组 稀释剂回 收率 试验组回 收率 大肠埃 布菌 3 1 93 0 0 92 84 98.9% 90.3% 3 2 89 0 0 87 82 97.8% 92.1% 3 3 82 0 0 81 74 98.8% 90.2% 金黄色萄 萄球菌 3 1 97 0 0 96 85 99.0% 87.6% 3 2 96 0 0 93 78 96.9% 81.2% 3 3 90 0 0 90 84 100% 93.3% 枯草芽孢 杆菌 3 1 91 0 0 90 87 98.9% 95.6% 3 2 92 0 0 90 87 97.8% 94