生物制药技术单克隆抗体.pptx

单克隆抗体技术;可用抗体治疗的疾病;治疗用抗体发展的三个阶段; 1975年8月7日，Kohler和Milstein在Nature上发表了一篇报道,题为Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.(Nature 1975;256:495) “可分泌预定特异性抗体的融合细胞的持续培养。” 这一文献已成为一篇经典的文献, 对生物学和医学领域中的基础和应用研究有着深远的意义。为此,Kohler和Milstein 获得了1984年诺贝尔医学生理学奖。这一技术上的突破, 在制造和使用抗体方面开创了一个新纪元。所以 Mab 被称为第二代抗体。 ;治疗性抗体 (Therapeutical Monoclonal Antibodies) 26种;;淋巴细胞;一、抗体的结构和功能 1、一个抗体分子包括两个完全相同的重链分子（H）和两个完全相同的轻链分子（L） 2、用木瓜蛋白酶处理可将抗体分解为3个部分，即两个Fab片段和个Fc片段： Fab：保存与抗原结合的活性和特异性 Fc：抗体结合抗原后激活机体免疫反应的主要部位;;Basic Structure of Ab Molecules 抗体分子的基本结构;;重链由约450个氨基酸（IgG、IgA、IgD）或570个氨基酸（IgM、IgE）组成，轻链由约214个氨基酸组成。完整抗体的相对分子质量约为150 kDa。在Ig分子氨基端，L链的1/2区段与H链的1/4区段的氨基酸组成及排列顺序多变，称为可变区（variable region, V区）；羧基端L链的1/2区段与H链的3/4区段的氨基酸组成和排列比较恒定，称为恒定区（constant region, C区）。;在V区中，某些特定位置的氨基酸残基显示更大的变异性，构建了抗体分子和抗原分子发生特异性结合的关键部位，称为互补决定区（complementary determining region, CDR ），它是V区中特异结合抗原的部位。而C区则决定了Ig分子的异种抗原性，主要发挥抗体分子的效应功能。;重链和轻链V区中各有3对CDR（CDRl，CDR2，CDR3），每个CDR长约5个~16个氨基酸。V区中CDR以外的部分称为框架区（framework region, FR），FR区为β片层（β-sheet）结构，氨基酸组成相对保守，不与抗原分子直接结合，但对维持CDR的空间构型起着极为重要的作用。;L链有VL和CL两个功能区，H链有VH和CH1、CH2、CH3等4个功能区。VL和VHCDR区共同构成一个抗原结合部位。 哺乳类的轻链有两种型别，κ型和λ型。重链可分为μ、ε、γ、δ、α 5类。 ; 多克隆抗体：由于一个抗原通常都有几个抗原决定簇，因此每个免疫细胞都可能产生一种针对某一抗原决定簇的抗体，这些由同一抗原产生的不同抗体统称为多克隆抗体。 ;一,单克隆抗体定义;McAb的主要特点:;; 1975年,英国剑桥大学分子生物学研究室的Kohler和Milstein首先应用绵羊红细胞免疫小鼠的脾细胞与多发性骨髓瘤细胞株(P3X63-Ag8)混合,加入仙台病毒,进行融合后, 在选择性培养基HAT[H,Hypoxanthin次黄嘌呤;A,Aminopterin氨基喋呤,T,Thymidine胸腺密啶核苷]上克隆再克隆, 得到单株无性繁殖杂交瘤细胞系。在基培养液的上清中或接种到小鼠腹腔的腹水中,含有高度专一的，能在单个抗原中决定簇水平上选择Ag的特异性抗体.这种Ab系由单株系细胞所产生,因此称为MAb。 ;利用杂交瘤细胞系生产单克隆抗体;;病毒 聚乙二醇（PEG） 电融合技术;;PEG 的作用机制;3、杂交瘤细胞的选择 HAT培养基（次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶） 核酸合成途径： 全合成途径（被叶酸拮抗剂氨基蝶呤阻断） 补救途径（关键酶为次黄嘌呤磷酸核糖转移酶 HGPRT）;;核苷酸的合成(从无到有);;补救途径;;（1），有限稀释技术 柏松分布 （2），半固体琼脂培养法 0.5%琼脂培养 基中 进行克隆;; 1、单克隆抗体活性检测 原理：酶联免疫吸附实验（ELISA） 2、杂交瘤染色体分析 3、 Ig 亚类分析鉴定 ①?先分析Ig类型,IgG,A,M ②?再分析亚类,IgG1,IgG2a,IgG2b 4、单克隆抗体纯度鉴定 ;?1. 包被已知抗原: Ag要纯, Ag 越纯，特异性越高。