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及时荧光定量PCR详细实验步骤
及时荧光定量PCR详细实验步骤
及时荧光定量PCR详细实验步骤
以下实验步骤仅供参照:
样品 RNA的抽提
① 取冻存已裂解的细胞,室温搁置 5 分钟使其完整溶解。
② 两相分别每 1ml 的 TRIZOL试剂裂解的样品中加入
0.2ml 的氯仿,盖紧管盖。
手动强烈振荡管体 15 秒后, 15 到 30℃ 孵育 2 到 3 分钟。 4℃ 下 12000rpm
离心 15 分钟。离心后混淆液体将分为基层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。 RNA所有被分派于水相中。水相上层的体积大概是匀浆时加入的TRIZOL试剂的 60%。
RNA 积淀将水相上层转移到一洁净无 RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混淆以积淀此中的 RNA,混匀后 15 到 30℃孵育 10 分钟后,于 4℃下
12000rpm 离心 10 分钟。此时离心前不行见的 RNA积淀将在管底部和侧壁上形成胶状积淀块。
④ RNA 冲洗移去上清液,每 1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入起码 1ml 的
75%乙醇( 75%乙醇用 DEPCH
2O 配制),冲洗 RNA积淀。混匀后, 4℃下 7000rpm 离心 5 分钟。
⑤ RNA 干燥当心吸去大多数乙醇溶液,使 RNA积淀在室温空气中干燥 5-10 分钟。
⑥ 溶解 RNA积淀溶解 RNA 时,先加入无 RNA酶的水 40μl用枪频频吹打几次,使其完整溶解,获取的 RNA溶液保留于 -80℃待用。
RNA质量检测
1)紫外汲取法测定
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先用稀释用的 TE溶液将分光光度计调零。而后取少许 RNA溶液用 TE稀释
(1:100)后,读取其在分光光度计 260nm 和 280nm 处的汲取值,测定 RNA溶
液浓度和纯度。
① 浓度测定
A260 下读值为 1 表示 40 μ g RNA/ml。样品 RNA浓度 ( μ g/ml)计算公式为:
A260×稀释倍数 × 40 μ g/ml。详细计算以下:
RNA 溶于 40 μ l DEPC水中,取 5ul,1:100 稀释至 495μl的 TE中,测得 A260=
0.21
RNA 浓度 =
0.21 × 100 × 40 μ g/ml = 840或 μ g/ml
0.84 μ g/ μ l
取 5ul 用来丈量此后,节余样品 RNA为 35 μl,节余 RNA总量为:
35 μ l ×
0.84 μ g/ μ l =
29.4 μ g
② 纯度检测
RNA 溶液的 A260/A280 的比值即为 RNA纯度,比值范围
1.8 到
2.1 。
2)变性琼脂糖凝胶电泳测定
① 制胶
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1g 琼脂糖溶于 72ml 水中,冷却至 60℃,10 ml 的 10× MOPS电泳缓冲液和 18ml 的 37%甲醛溶液 (
12.3 M) 。
10× MOPS电泳缓冲液
浓度成分
0.4M MOPS,pH
7.0
0.1M 乙酸钠
0.01M EDTA
灌制凝胶板,预留加样孔起码能够加入 25 μl溶液。胶凝后取下梳子,将凝胶板放入电泳槽内,加足量的 1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
② 准备 RNA样品
取 3μgRNA,加 3 倍体积的甲醛上样染液,加 EB于甲醛上样染液中至终浓度为 10μg/ml。加热至 70℃孵育 15 分钟使样品变性。
③ 电泳
上样前凝胶须预电泳 5min,随后将样品加入上样孔。 5–6V/cm 电压下 2h,电泳至溴酚兰指示剂进胶起码 2–3cm。
④ 紫外透射光下察看并摄影
28S 和 18S核糖体 RNA的带特别亮而浓(其大小决定于用于抽提 RNA的物种种类),上边一条带的密度大概是下边一条带的 2 倍。还有可能察看到一个
更小略微扩散的带,它由低分子量的 RNA(tRNA 和 5S核糖体 RNA)构成。在18S和 28S核糖体带之间能够看到一片弥散的 EB染色物质,可能是由 mRNA和其余异型 RNA构成。 RNA制备过程中假如出现 DNA 污染,将会在 28S核糖体
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RNA带的上边出现,即更高分子量的弥散迁徙物质或许带, RNA的降解表现为核糖体 RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。
3 样品 cDNA 合成
① 反响系统
序号反响物剂量
1 逆转录 buffer2μl
上游引物
0.2 μl
下游引物
0.2 μl
dNTP
0.1 μl
逆转录酶 MMLV
0.5 μl
DEPC水 5μl
RNA模版 2μl
整体积 10μl
轻弹管底将溶液混淆, 6000rpm 短暂离心。
② 混淆液在加入逆转录酶 MMLV 以前先 70℃干浴 3 分钟,拿出后立刻冰水浴至管内外温度一致,而后加逆转录酶
0.5 μl,37℃水浴 60 分钟。
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