基因文库的构建方法、待测核酸样本基因突变的检测方法及试剂盒发明专利.doc

— —— PAGE \* MERGEFORMAT2 — — — PAGE \* MERGEFORMAT19 —— — —— PAGE \* MERGEFORMAT1 —— 基因文库的构建方法、待测核酸样本基因突变的检测方法及试剂盒 技术领域 本发明涉及基因测序领域，具体涉及一种基因文库的构建方法、待测核酸样本基因突变的检测方法及试剂盒。 背景技术 恶性肿瘤(癌症)已经成为严重威胁中国人群健康的主要公共卫生问题之一，根据必威体育精装版的统计数据显示，恶性肿瘤死亡占居民全部死因的23.91％，近10多年来，恶性肿瘤发病率每年保持约3.9％的增幅，死亡率每年保持2.5％的增幅。随着对肿瘤研究的不断深入，治疗癌症的方法手段也在不断更新。近几年来，除传统的放化疗治疗手段外，靶向治疗、免疫治疗，包括单克隆抗体类免疫检查点抑制剂、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞治疗等新方法不断涌现，实现了对肿瘤更精准有效、毒副作用更小的个体化治疗。但这些治疗离不开对肿瘤基因组变异信息的深入解读，在此基础上才能制定个体化治疗方案。 目前，高通量测序技术已广泛应用到医学研究和临床诊断领域，为致癌位点的检测提供了新的检测手段。高通量测序技术因其结果覆盖范围的全面性，以及不断下降的测序成本，在医学研究和临床应用中表现出越来越高的性价比。有限的样本量和检测报告输出的时效性对该技术提出了更高的要求。简化文库构建流程、提高低起始量样本的建库成功率势在必行。通过优化和改进文库构建方法，缩短酶反应时间和建库步骤、提高样本转化成文库的效率、防止样本间的相互污染成为高通量测序技术拓展应用领域的关键点。 发明内容 本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种基因文库的构建方法、待测核酸样本基因突变的检测方法及试剂盒。 本发明的发明人在研究过程中发现： 高通量文库构建步骤包括：(1)基因组打断(包括物理打断法和酶打断法，如covaris超声打断、 fragmentase酶切打断)；(2)双链DNA(Deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸)末端修复；(3)3’末端加‘A’(用于TA克隆)；(4)加与测序平台匹配的接头；(5)PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)扩增。整个流程需要大概8-9个小时才能完成。为简化流程，一些生物公司推出了新的建库技术，如Illumina公司提出了基于转座酶的打断与加接头一步完成的快速建库方法，华大基因及Qiagen 公司等一些单位也相继推出了基于酶切打断的文库构建方法，能有效的简化流程，由于酶的特性，酶切方法基本导致碱基偏向性问题。同时为了避免样本DNA在文库构建过程中损失，很多试剂盒推荐使用成本较高的低吸附管和吸头作为常规实验耗材。 在文库构建接头连接环节，现有技术基本上连接的是一端含有标签序列的接头，通过引入的标签序列进行样本间的区分，以便同时可以混合多个样本一同上机测序，节约测序成本。但接头在合成制备的过程中，以及PCR或测序过程中，可能会存在错误碱基的引入，从而可能造成交叉污染，影响低频突变检出的准确性。目前解决该问题常用的策略是UMI(Unique Molecular Identifier)和双标签(Dual Index)。 如上所述，经典的高通量文库构建方法是目前接受度最广、数据表现最稳定、数据偏向性最少的建库方法，但其建库过程耗时较长，对样本起始量要求较高，日益无法满足快速发展的市场对低起始量微量建库和快速报告周期的需求，这一点在高通量测序技术在临床方面的应用中表现的更为突出。而转座酶建库技术，虽然能够满足低起始量和快速建库的要求，但其数据偏向性又在一定程度上限制了该方法的大范围推广。另外，商品化建库试剂盒往往只针对一种来源的DNA样本，且成本较高。所以如果能对经典的高通量建库方法进行改良，在保持其现有优势的基础上降低其所需的样本起始量并缩短建库时间同时可兼容多种来源样本，将极大的推进高通量测序方法在市场上特别是医学研究和临床方向的应用，为相关领域研究和临床应用提供更有利的方法和技术。 在NGS测序过程中往往会多个样本混合在同一个通道中测序。为了区分出各个样本，文库构建过程会为每个样本带上固定的标签序列(index)以进行区分。目前的标签序列方式主要包括以下三种：(1) 单index模式，在接头连接或PCR扩增的环节将固定序列引入到样本中，该模式容易引起样本串扰污染； (2)双index模式，在接头及PCR引物中均含有相同的标签序列，能有效降低样本间的污染，解决串扰问题，但在测序过程中，可能出现拆分率低、样本下机数据量少的现象。(3)UMI+双index模式，在接头中带有一段随机的UMI(Unique Molecular Identifier)