双链核酸环化方法、甲基化测序文库构建方法和试剂盒发明专利.pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 112795620 A (43)申请公布日 2021.05.14 (21)申请号 201911104524.4 (22)申请日 2019.11.13 (71)申请人 深圳华大基因股份有限公司 地址 518083 广东省深圳市盐田区洪安三 街21号华大综合园7栋7层-14层 (72)发明人 唐冲　王娟　何长寿　童益琴　 杨林峰　高强　 (74)专利代理机构 深圳鼎合诚知识产权代理有 限公司 44281 代理人 彭家恩　罗瑶 (51)Int.Cl. C12Q 1/6806(2018.01) C12N 15/10(2006.01) C40B 50/06(2006.01) 权利要求书2页 说明书9页 附图4页 (54)发明名称 双链核酸环化方法、甲基化测序文库构建方 法和试剂盒 (57)摘要 一种核酸双链环化方法、甲基化测序文库构 建方法和试剂盒。本发明的核酸双链环化方法， 包括：提供正向引物和反向引物，均包含一个U碱 基，二者的U碱基5’端上游序列的核苷酸数相差N 个，正向引物与反向引物的U碱基5’端上游序列 至少部分反向互补；使用引物对扩增核酸片段得 到扩增产物；使用USER酶将扩增产物中的U碱基 切除，进而形成单核苷酸缺口，从缺口至5’末端 的剩余核酸序列由于结构不稳定而发生链解离， 进而在扩增产物两端形成部分互补的粘性末端 结构；使两端的粘性末端结构互补连接形成双链 A 结构，该双链结构的一条链闭合，另一条链具有N 0 个碱基缺失。本发明用于WGBS文库构建，能够降 2 6 5 低WGBS文库因单链环化偏向性造成的甲基化率 9 7 2 偏高的现象。 1 1 N C CN 112795620 A 权　利　要　求　书 1/2页 1.一种双链核酸环化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： 提供一对用于扩增双链核酸片段的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，所 述正向引物和反向引物上均包含一个U碱基，所述正向引物的U碱基5’端上游序列的核苷酸 数与所述反向引物的U碱基5’端上游序列的核苷酸数相差N个，N是大于等于1的正整数，并 且，所述正向引物的U碱基5’端上游序列与所述反向引物的U碱基5’端上游序列至少部分反 向互补； 使用所述引物对扩增所述双链核酸片段得到扩增产物，所述扩增产物两端分别包含所 述正向引物和反向引物的序列； 使用USER酶将所述扩增产物中的U碱基切除，进而形成单核苷酸缺口，从所述缺口至5’ 末端的剩余核酸序列由于结构不稳定而发生链解离，进而在所述扩增产物两端形成部分互 补的粘性末端结构； 在连接酶作用下，使两端的粘性末端结构互补连接以形成环状双链结构的核酸，其中 所述环状双链结构的核酸的一条链闭合，另一条链具有N个核苷酸缺失。 2.根据权利要求1所述的核酸双链环化方法，其特征在于，所述N是1-7的任一整数； 任选地，所述剩余核酸序列的长度为2-20nt。 3.一种甲基化测序文库构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： 提供两端分别连接有甲基化接头的双链DNA片段； 使用重亚硫酸盐处理所述两端分别连接有甲基化接头的双链DNA片段，使非甲基化的C 碱基转换成U碱基； 通过PCR扩增重亚硫酸盐处理后的转换产物，使U碱基转换成T碱基，从而获得扩增产 物，其中所述PCR扩增使用的引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物上 均包含一个U碱基，所述正向引物