一种适用于下一代测序平台的低起始量建库方法发明专利.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 109207557 A (43)申请公布日 2019.01.15 (21)申请号 201710551477.2 (22)申请日 2017.07.07 (71)申请人 深圳华大基因股份有限公司 地址 518083 广东省深圳市盐田区洪安三 街21号华大综合园7栋7层-14层 申请人 广州华大基因医学检验所有限公司 (72)发明人 张盼　叶明芝　程少敏　王晶晶　 李志隆　 (74)专利代理机构 深圳鼎合诚知识产权代理有 限公司 44281 代理人 孙银行　彭家恩 (51)Int.Cl. C12Q 1/6806(2018.01) C40B 50/06(2006.01) 权利要求书1页 说明书16页 序列表9页 附图1页 (54)发明名称 一种适用于下一代测序平台的低起始量建 库方法 (57)摘要 一种适用于下一代测序平台的低起始量建 库方法，包括：DNA片段化；末端修复；用磁珠纯化 末端修复产物，并保留磁珠在体系中；接头连接； 用磁珠纯化接头连接产物两次，并去除磁珠；以 纯化的接头连接产物为模板，进行PCR扩增；用磁 珠筛选第一次PCR扩增产物；将片段筛选的产物 与芯片进行杂交；用磁珠对杂交产物进行捕获， 然后通过洗脱去除非捕获目的基因和其它杂质； 以洗脱后的带磁珠的DNA为模板进行PCR扩增，以 进一步放大目的基因信号；用磁珠纯化第二次 PCR扩增产物两次。本发明的方法可同时检测 A SNV、Indel、融合和CNV四种突变类型样本，建库 7 起始量降低至100ng以下，可以满足绝大多数穿 5 5 7 刺样本的检测。 0 2 9 0 1 N C CN 109207557 A 权　利　要　求　书 1/1页 1.一种适用于下一代测序平台的低起始量建库方法，其特征在于，包括如下步骤： （1）DNA片段化：将提取的DNA打断成片段； （2）末端修复：将打断的DNA片段加入到末端修复反应液中，进行孵育； （3）第一次纯化：用磁珠纯化末端修复产物，并保留磁珠在体系中； （4）接头连接：将纯化后的末端修复产物连同磁珠一起加入到连接反应液中，同时加入 接头，进行孵育； （5）第二次纯化：用磁珠纯化接头连接产物两次，并去除磁珠； （6）第一次PCR扩增：以纯化的接头连接产物为模板，进行PCR扩增； （7）片段筛选：用磁珠筛选第一次PCR扩增产物； （8）杂交：将片段筛选的第一次PCR扩增产物与芯片进行杂交； （9）捕获和洗脱：用磁珠对杂交产物进行捕获，然后通过洗脱去除非捕获目的基因和其 它杂质； （10）第二次PCR扩增：以洗脱后的带磁珠的DNA为模板进行PCR扩增，以进一步放大目的 基因信号； （11）第三次纯化：用磁珠纯化第二次PCR扩增产物两次。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中DNA来源于肿瘤穿刺样本。 3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中DNA的量是10ng至100ng。 4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中DNA打断成大小为200bp左 右的片段。 5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中用1.8倍AM