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山药组织培养管理论文 论文关键词:山药组织培养外植体褐化抗氧化剂培养基质 论文摘要:笔者从山药不同外植体(叶、茎段、零余子)、培养基中添加抗氧化剂和不同培养基质3个方面进行试验研究。结果表明,山药不同外植体的褐化程度也不一样,茎段褐化程度最轻;MS培养基中添加150mg/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)能有效抑制外植体的褐化;在山药组培苗的快繁阶段采用液体基质培养方式能显著降低褐化程度,提高山药组培苗成活率。 山药(Chineseyam)具有较高的药用价值及营养价值，主要食用器官为地下块茎，为大众化的滋补食品，通过组织培养技术不仅可进行快速繁殖，而且能使优良品种种性得以保存延续[1,2]。但山药在组织培养过程中存在着严重的褐化发应，经常发现山药组培苗或外植体枯死及其基部培养基颜色黑褐化，这种褐化现象又称为酚污染，严重影响外植体的脱分化和培养物的再分化[3]。因此，为了山药组织培养工厂化育苗的顺利进行，笔者就山药组织培养过程中的褐化现象及有效控制等方面进行了研究探讨。 1材料与方法 1.1材料 供试材料为寸金薯叶片、茎段、零余子等常用组培外植体为材料[2]，山药品种寸金薯来自福建龙岩大池镇。 1.2方法 1.2.1不同外植体褐化反应研究观察从生长植株上取其幼嫩茎节间部茎段、完全伸展的叶片及结出的零余子为外植体，先将外植体用自来水反复冲洗后，在无菌条件下，用70%酒精消毒20~30s，再放入2%次氯酸钠溶液中消毒10~15min，再用无菌水漂洗3~4次，最后将外植体切成大小适合的小块接种在已配好的MS培养基中进行培养[1,2,4]。叶片大小为0.3~0.5cm方形，茎段（含节间）0.6~0.8cm，零余子切成0.5~0.6cm左右大小的方块，琼脂0.7%，PH值为5.8，培养温度25±2℃，光照强度为2000lx，每天光照时间16h。共3种处理，每种处理30瓶，每瓶一个外植体，重复3次，培养30d后观察外植体褐化程度。 1.2.2不同外源物质(抗氧化剂)对外植体褐化的抑制作用以山药含节间部的茎段(0.6~0.8cm)为外植体，经灭菌处理后，接种在以下3种处理的MS培养基(PH=5.8)中进行培养：A：MS+150mg/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，B：MS+80mg/L半胱氨酸[5,6]，C：MS+0.1%活性炭，每处理30瓶，每瓶一个外植体，重复3次，观察外植体的褐化情况。 1.2.3不同培养基质对外植体褐化的影响以山药茎段愈伤组织分化出的组培苗为外植体，分别接种在MS+0.7%琼脂（固体培养）和未加琼脂的MS培养基（液体培养）中进行快繁培养，每处理30瓶，每瓶一个外植体，重复3次，观察其在快繁过程中的褐化情况。 2结果与分析 2.1不同外植体的褐化反应 由此次试验结果可知，利用山药不同外植体进行组织培养时，其褐化的程度也不同。当外植体为含节间的茎段时，其褐化程度最轻，当外植体为切成小方块的零余子时，褐化现象最严重，叶片的褐化程度居中。表1为此次试验观察统计，由表中的原始数据可看出，零余子褐化程度极其严重，在试验观察过程中发现采用零余子小块为外植体的培养基均大面积出现黑褐色现象，甚至发现有外植体枯死。可能是因为本身零余子内所含酚类物质较多，再加上进行接种前切成小块材料，损伤面较大，损伤面细胞中的酚类物质，与氧气聚合发生氧化反应，形成较多的有毒醌类物质，扩散到培养基中，从而抑制其它酶的活性，毒害整个外植体组织[7,8]。 2.2不同外源物质对褐化的抑制作用 根据试验观察结果，加入3种外源物质在早期均能有效抑制外植体的褐化，但随着培养时间的延长，3种外源物质抑制褐化作用开始分化，C处理（MS+0.1%活性炭）最早发现外植体褐化，而且随着培养时间的再次延长，褐化现象越来越重，外植体基部培养基褐化块直径最大达到4cm；MS+80mg/L半胱氨酸组合在褐化抑制作用上较好于C处理，此次试验表现出最佳抑制效果的是A组合，即：MS+150mg/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，其在培养早期发现只有2个样本有轻微褐化现象，而且随着培养时间的逐步增加，褐化程度表现也并不十分明显，仅仅在培养35d左右时，在外植体基部培养基出现了少量的褐化现象，而且褐化块的直径仅为0.8cm左右，各处理褐化抑制作用趋势见图1所示，组合B与组合C的发生褐化平均瓶数在同一培养时间段均高于组合A，同时组合A在培养20d至40d时间段出现褐化样本数增幅不大，所以图1组合A的抑制作用趋势图也较组合B与组合C平稳，因此组合A对样本褐化的抑制起到了较好的作用。 2.3不同培养基质对外植体褐化的影响 外植体褐化现象在固体基质培养