实验四__重组蛋白的SDSPAGE.pptx

实验四、 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳　　　　　　法测定蛋白质的分子量;1 实验目的;纸电泳 琼脂糖电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 毛细管电泳;SDS－PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）， 1967年由Shapiro等建立 1969年由Weber和Osborn进一步完善 用于测蛋白质亚基分子量 ;;;;;1 样品浓缩效应;(1)凝胶孔径不连续性: 浓缩胶 T=5% 孔径大 分离胶T=7%－15% 孔径小 在2层凝胶交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。 ;(2)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性: Tris: 缓冲配对离子，维持溶液的电中性及pH值 Cl-:在电场中迁移率快，前导离子(leading ion) ，快离子。 Gly:其pI =6.0，在pH6.7的浓缩胶缓冲体系中，甘氨酸解离度很小，因而在电场中迁移很慢，称为尾随离子（trailing ion），慢离子。 当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质;因此Cl-及NH2CH2COO-沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大，被留在后面,然后再分成多个区带. 大多数蛋白质在pH6.7或8.3时均带负电荷，在电场中，都向正极移动。 ;;(3)电位梯度的不连续性 V(电泳速度)=E(电位梯度) * m(迁移率) E高m慢≈E低m快 由于蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间，因此也就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩形成一个狭小的中间层。 ;2 分子筛效应;3 电荷效应;凝胶浓度与被分离物分子量的关系： 由于凝胶浓度不同，平均孔径不同，能通过可移动颗粒的分子量也不同.;;在一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质 SDS的硫酸根带负电，使各种蛋白质的SDS复合物都带上相同密度的负电荷，大大超过蛋白质分子原有的电荷，因而屏蔽了不同种类蛋白质分子之间原有的电荷差异，从而使蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关，这样便能直接从电泳迁移率计算出蛋白质的分子量。 ;;;根据上述方程将已知分子量的标准蛋白质电泳迁移率与分子量的对数作图，可制出一条标准曲线，测出同样条件下待测蛋白质的电泳迁移率，即可从标准曲线上查出其分子量 本法测定分子量的误差约为10%。 ;蛋白质完全变性 二硫键全部还?? 与SDS充分结合 ;二硫苏糖醇（DTT） 0.3g (或β-巯基乙醇) 1mL 10%SDS 4 mL 浓缩胶缓冲液 1.6 ml 87%甘油 2.5 g 0.05%溴酚蓝 2mL ddH2O 至20mL 1 mL/管分装，－20℃保存。 ;蛋白质的二硫键是否完全被还原。只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下，SDS才能定量地结合到蛋白质分子上去，并使之具有相同的构象。所以样品处理时需加β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）。 样品处理液中SDS单体的浓度:为了保证蛋白质与SDS的充分结合，溶液中SDS的总量至少要比蛋白质高3-4倍，甚至10倍以上。 样品处理液的离子强度：应保持较低的离子强度（低于0.26），这样才能保证SDS有较高的单体浓度，与蛋白质充分结合。若样品的离子强度太高，需先透析或凝胶过滤除盐。 样品中的蛋白质浓度需适当。浓度过高，易造成拖尾，甚至影响蛋白质迁移率与分子量对数的线性关系；浓度太低则不易检测。通常根据样品含有的蛋白质种类多少及所使用的检测方法确定蛋白质浓度，如用考马斯亮蓝染色，每种蛋白的浓度应为20～30μg /ml,若用银染，则只需0.3～0.5μg /ml。;用样品缓冲液（0.08M Tris-Cl， pH6.8）配制成每种标准蛋白质浓度均为0.5μg /ul的溶液，－20℃保存。使用前置室温融化后，沸水浴中加热3-5分钟后上样。;配置贮备溶液 ;G.　10×SDS电极缓冲液(PH8.3)： 　Tris base (FW121.1) 250mM　Glycine (FW 75.1) 2M 　SDS (FW288.4) 1% (W/V) 　ddH2O to 100mL I.　固定染色液： 　考马斯亮蓝R-250 0.58g 　95%乙醇 250mL　冰醋酸 50mL ddH2O 200mL 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 K.　脱色液： 　95%乙醇 250mL　冰醋酸 80mL 　ddH2O　1000mL;3.1 安装垂直板电泳槽 3.2 分离胶制备 12％,