备课素材：原生质体的分离与纯化.docxVIP

原生质体的分离与纯化 植物原生质体是指脱去全部细胞壁由质膜包被的具有生命活力的裸露细胞。它具有细胞生命特征和全能型，是细胞无性系变异和突变体筛选的重要来源，同时也是植物遗传工程的理想受体和遗传改良的理想材料。 细胞壁的主要成分是纤维素、半纤维素、果胶质和少量蛋白质等。高等植物分离原生质体研究最早是1892年Klercker用机械法进行的，但无法获得大量有活力的原生质体，取材又局限于液泡化程度较大的细胞或长形细胞的组织，原生质体的研究进展缓慢。直到1960年，Cocking用酶成功地分离出大量原生质体后，才为深入研究打开道路。 那么,原生质体如何分离？ 试题解析??? 试题：在植物的细胞培养中，有多种方法可提取原生质体。原生质体的分离与培养成功解决了植物组织培养、植物克隆等方面的难题，标志着植物细胞工程技术向前迈进了一大步。以下说法正确的是（? ??） A．提取原生质体唯一有效的办法是酶解法 B．把原生质体放入高渗溶液中，可正常膨大 C．通过原生质体融合再生植株可克服远缘杂交的不亲和性，但不是遗传转化的理想受体 D．原生质体的获得再一次证明植物细胞质壁分离现象的存在 解析： 酶解法是理想方法,但不是唯一的，比如物理机械磨损也可以，A错误；将原生质体放在高渗溶液中因为失水会萎缩的，B错误；通过原生质体融合再生植株可克服远缘杂交的不亲和性，也是遗传转化的理想受体，扩大了基因工程的受体范围，C错误；原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活的植物细胞的最小单位，因此原生质体的获得再一次证明植物细胞质壁分离现象的存在，D正确。故正确的答案为D。 ?原生质体的分离方法? ? 1.机械分离法 原生质体的机械分离法是借助于利器如刀或机械磨损等措施使细胞壁破损，促使原生质体释放的方法。即将叶肉细胞、愈伤组织和液体悬浮培养细胞置于高渗的糖溶液中（并不是一定用教材中所说的甘露醇），使之发生质壁分离，原生质体收缩成球形，然后用剪刀剪碎组织，就可切开细胞壁获得少量完整的原生质体。用机械法分离细胞的明显优点是细胞不会受到酶的伤害，有利于开展生理生化研究。一般只有在薄壁组织排列松散、细胞间接触点很少时，用机械法分离叶肉细胞才能取得成功，如洋葱球茎鳞片、萝卜根、甜菜根组织等。但用机械法分离游离细胞其产量低，不易获得大量活性细胞，所以一般实验室不用这种方法，只是在用酶解法酶解细胞壁时有很多副作用时，可采用此法。2.酶解分离法 Cocking在1960年用提取浓缩的纤维素酶溶液降解细胞壁，开创了大量分离原生质体的新技术。Takabe等在1968年首次使用商品酶试剂分离原生质体，并获得再生植株。现在，经过细胞壁降解酶混合溶液（溶液中含有渗透稳定剂）处理过的组织来获得原生质体，成为目前普遍采用的分离方法。 由于酶解法分离法可以获得大量原生质体，几乎可以从所有植物的组织器官中分离得到原生质体，并且酶解时仅发生轻微的渗透收缩，不必发生质壁分离，对活细胞的损伤较轻，所以，酶解法得到迅速发展。 酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶、离析酶和果胶酶能降解细胞壁成分，去除细胞壁，即可得到原生质体。这些酶均是从不同的微生物中提取的。 果胶酶、离析酶主要分解细胞之间的果胶，促使细胞彼此分离。在原生质体分离时，常将降解纤维素的酶和降解果胶的酶混合使用，利用果胶酶分解果胶质的特性从组织中将细胞游离出来，再在纤维素酶的继续作用下把细胞壁分解而释放出原生质体。所以，酶液的种类、组合、浓度和酶解的时间对原生质体分离效果有很大影响。 另外，蜗牛酶和胼胝质酶主要用于花粉母细胞和四分孢子原生质体分离，因为花粉母细胞和四分孢子的细胞壁中除了有纤维素外，还有由几丁质和多糖等构成胼胝质。3.植物原生质体的分离与纯化 方法步骤：叶片表面消毒→去除表皮→叶碎片漂浮在含有酶和渗透压稳定剂的溶液中→培育→原生质体沉到培养皿底部→除去酶溶液→将原生质体移入CPW清洗（原生质体洗涤液）→离心→清洗基质两次→重悬浮于培养基→除去小的个体，用血球计计数→调整到合适的密度重悬浮于培养基。 原生质体分离和纯化 （1）将撕去表皮的植物叶片或花瓣置于酶液（pH6.9，去表皮面接触酶液），在25℃黑暗条件下，酶解1～2小时。（2）用350目网过滤除去未完全消化的叶片等残渣。（3）在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清液。加入3～4ml 13%CPW洗液，相同条件下离心，弃上清液。加1ml 13%CPW洗液悬浮。（4）纯化分离方法之一－蔗糖漂浮法去除碎片。用细口吸管吸20%蔗糖溶液约3ml，小心插入盛有原生质体悬液的离心管底部，缓缓将蔗糖溶液挤出，由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液