过氧化氢酶米氏常数的测定.pdf

生化实验 过氧化氢酶米氏常数的测定 傅璐 121140012 2013/11/28 过氧化氢酶米氏常数的测定 傅璐 121140012 一、 实验目的 1. 了解米氏常数的测定方法 2. 学习提取生物组织中的酶 二、 实验原理 1. 米氏反应动力学 米氏方程 (Michaelis-Menten Equation): 2. 米氏常数的意义： ① 反映酶的种类： Km 是一种酶的特征常数，只与酶的种类有关，与酶浓度、 底物浓度无关。 ② 米氏常数是酶促反应达到最大反应速度 Vmax 一半时的底物浓度。其数值大 小反映了酶与底物之间的亲和力： Km 值越大，亲和力越弱，反之 Km 值越 小，亲和能力越强。 ③ Km 可用来判断酶 （多功能酶）的最适底物： Km 值最小的酶促反应对应底物 就是该酶的最适底物。 3.米氏常数的求法： 该方法的缺点是难以确定最大 反应速度 Vmax 。 文档 生化实验 过氧化氢酶米氏常数的测定 傅璐 121140012 2013/11/28 该作图法应用最广。但在低浓度是 v 值误差较大，在 [S]等差值实验时作图点较 集中于纵轴。因此在设计底物浓度时，最好将 1/[S]配成等差数列，这样可使点 距较为平均，再配以最小二乘回归法，就可以得到较为准确的结果。 此法优点是横轴上点分布均匀，缺点是 1/v 会放大误差，同时对底物浓度的选择 有要求。 [S]Km 时图形近于水平线， [S]Km 时直线将在原点附近与轴相交。 4.氧化酶：生物体内重要的三种氧化酶类，其作用均是消除体内自由基： ① POD：过氧化物酶 ② SOD:超氧化物歧化酶 ③ CAT：；过氧化氢酶 5.过氧化氢酶的作用： 植物体内活性氧代谢加强而使过氧化氢发生积累。 过氧化氢可进行一步生成 氢氧自由基。 氢氧自由基是化学性质最活泼的活性氧， 可以直接或间接地氧化细 胞内核酸、蛋白质等生物大分子，并且有非常高的速度常数，破坏性极强，可使 细胞膜遭受损害，加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶（ catalase，CAT ）可以清 除过氧化氢、分解氢氧自由基，保护机体细胞稳定的内环境及细胞的正常生活， 因此 CAT 是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植物的抗逆性密 切相关。 6.过氧化氢酶活力的测定方法： 文档 生化实验 过氧化氢酶米氏常数的测定 傅璐 121140012 2013/11/28 ①紫外吸收法： 过氧化氢在 240nm 波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶 液吸光度（ A240nm ）随反应时间而降低。根据测量吸光度的变化速度即可测出 过氧化氢酶的活性。 （以一分钟内 A240nm 下降 0.1 为一个单位） ②滴定法（高锰酸钾法、碘量法） 在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准 高锰酸钾溶液 （在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。 根据单位时间内消耗的过 氧化氢的量即可测出过氧化氢酶活力大小。 7.实验中的反应 ： H2O2 被过氧化氢酶分解出 H2O 和 O2 , 未分解的 H2O2 用 KMnO4 在酸性 环境中滴定 , 根据反应前