肾科实验方法汇总..docx

组织 RNA提取 样本总体积不能超过 一、准备工作 Trizol 体积的 10% 二、步骤 (一 ) TRIzol 法提取总 RNA 组织 (约 100g)＋ 1ml TRIzol ↓ 匀浆 (冰上预冷 )(转 1.5ml EP 管) ↓ 颠倒混匀，室温 5 分钟 ↓ 加 0.2ml 氯仿 ↓ 颠倒混匀 15 秒，室温 2～ 3 分钟 异丙醇使 RNA 变性， ↓ 离心： 4℃， 12000rpm ， 10 分钟 沉淀 ↓ 转上层水相 (约 400～ 500μl) 到 1.5ml EP 管 注：上层 RNA ；中层蛋 ↓ 白；下层 DNA 加等体积异丙醇 (约 400～ 500μ l) ，混匀，冰浴 10 分钟 注：异丙醇－ 20℃预冷 ↓ 离心： 4℃， 12000rpm ， 15 分钟 ↓ 弃上清 ↓ 加 1ml 75% 乙醇 ↓ 离心： 4℃， 8000rpm ， 5 分钟 ↓ 弃上清 ↓ 加 1ml 75% 乙醇 ↓ 离心： 4℃， 8000rpm ， 5 分钟 ↓ 弃上清 ↓ 加入 30～ 40μ l DEPC 水 ↓ 立即保存于－ 70℃冰箱中或立即用于逆转录 测浓度： 加去离子水稀释 100～ 600 倍测 260 值 1 RNA 浓度＝ OD260 值×稀释倍数 (100～ 600)× 40/1000 上样量＝ 5μ g/RNA 浓度 加 DEPC 水补足 10μl (二 )逆转录 (RT) (25μl 体积 ) 1、配制混合物一 (0.5ml EP 管 ) 模板 RNA5 μ g＋DEPC 水补足 10μ l ↓ 变性： 80℃水浴 × 5 分钟，迅速冰浴 2、配制混合物二 (0.5ml EP 管 )(每份 ) Oligo dT( 引物 ) 0.5μ l 5× Buffer 5μ l 20mM dNTPs 2μ l 0.1M DTT 1μ l RNA 酶抑制剂 0.5μ l M-MLV( 反转录酶 ) 1μ l DEPC 水 5μ l (补至 15μ l) 3、将混合物二加入已变性的混合物一中，混匀→ 37℃水浴 × 90 分钟 4、得 25μ l cDNA 放置于－ 20℃冰箱中。 提取总 RNA ，取 4u1RNA 溶液在 1.5% 的琼脂糖凝胶上电泳，如图示 28S, 18S 和 5S 三 条带清晰， 比例适当。 所有标本总 RNA 进行紫外分光光度计检测， A260/280 比值在 1.8-2.0 之间，表明 RNA 无明显降解，无明显 DNA 污染，质量符合实验要求。 DEPC 水的制备 DEPC 水：泡实验器具的 DEPC 水的配制： 1000ml 双蒸水中加 1mlDEPC ，放在 1000ml 容量瓶 中静置 4 小时后备用。 配 75％乙醇的 DEPC 水的配制： 100ml 盐水瓶内装 40ml 双蒸水，加 40ulDEPC ， ℃过夜，送至高压。 2 细胞 RNA提取 (一 ) TRIzol 法提取总 RNA PBS(2ml) 洗 2 遍细胞 ↓ 细胞＋ 1ml TRIzol ( 消化，反复吹打 ) 注： 6 孔板：加 0.5ml ； ↓ 1 培养瓶：加 1ml TRIzol 收集后转 1.5ml EP 管 ↓ 加 100μl 氯仿 ↓ 颠倒混匀 15 秒，室温 2～ 3 分钟 ↓ 离心： 4℃， 12000rpm ， 15 分钟 ↓ 转上层水相 (约 400～ 500μl) 到 1.5ml EP 管 注：上层 RNA ；中层蛋 ↓ 白；下层 DNA 加等体积异丙醇 (约 400～ 500μ l) ，混匀，冰浴 20 分钟 注：异丙醇－ 20℃预冷 ↓ 离心： 4℃， 12000rpm ， 15 分钟 ↓ 弃上清 ↓ 加 0.5ml 75% 乙醇 ↓ 离心： 4℃， 5000rpm ， 5 分钟 ↓ 弃上清 ↓ 加 0.5ml 75% 乙醇 ↓ 离心： 4℃， 5000rpm ， 5 分钟 ↓ 弃上清 ↓ 加入 0.5ml 75% 乙醇，加入 10μ l 左右 DEPC 水 ↓ 立即保存于－ 70℃冰箱中或立即用于逆转录 测浓度： 加去离子水稀释 50～ 100 倍测 260 值 注： RNA 浓度为 0.4～ RNA 浓度＝ OD260 值×稀释倍数 (50～100)× 40/1000 0.6 之间为佳 上样量＝ 5μ g/RNA 浓度 加 DEPC 水补足 10μl 3 (二 )逆转录 (RT) (25μl 体积 ) 1、配制混合物一 (0.5ml EP 管 ) 模板 RNA5 μ g＋DEPC 水补足 10μ l ↓ 变性： 80℃水浴 × 5 分钟，迅速冰浴 2、配制混合物二 (0.5ml EP 管 )(每份 ) Oligo dT 0.5