分子操作基本技术实验报告LB培养基的配制和大肠杆菌的培养.docxVIP

PAGE 25 PAGE 27 实验一 LB培养基的配制和大肠杆菌的培养 第一部分 理论知识 一．生物工程所需的微生物学原理 基因工程主要采用革兰氏阴性细菌作为宿主细胞表达系统。下面着重讲述大肠杆菌。 大肠杆菌的一般特性 大肠杆菌（Escherichia coli，简写为E.coli）属于革兰氏阴性细菌，大肠杆菌不仅能液体培养，也能在固体培养基上很好地生长。 在细菌培养过程中，有两方面的因素影响它的纯度：1.其它细菌造成的细菌污染。因此，用于培养的所有药品、器皿必须消毒，全部过程应在无菌条件下操作；2.遗传的异质性。遗传上的异质性发生在培养过程中原有细菌株系遗传成分的变异，导致原有标记性状的改变。其原因可能是天然突变的结果；或是在由质粒携带标记性状的情况下，异质性可能来自细胞分裂过程中质粒的丢失或质粒的分离。据目前所知，许多质粒以相当高的频率在寄主细胞分裂时发生分离，从而引起所带性状的变化。 2. 抗生素抗性 抗生素阻止细菌生长往往有抑菌和杀菌两种方式。 抑菌就是指药物仅仅使细菌生长受阻而未直接引起细胞死亡；而杀菌是指药物引起细胞裂解或死亡。一种抗生素抑菌或杀菌效果取决于细菌接触药物的条件。例如，大肠杆菌接触低水平的四环素将会通过四环素与核糖体结合，影响细菌蛋白质的合成而最终抑制细胞生长。然而，结合着四环素的核糖体是可恢复的，因为受抑制的细胞被稀释到无药物的培养基上，将会重新恢复正常细胞的生长。这种抑制的可恢复性表明四环素正以抑菌的方式发挥功能。当四环素浓度加大，阻止细菌声中的另一种方式变得明显而不可逆，亦即在高浓度下，四环素以杀菌方式发挥功能。 细菌有三种抗生素抗性的机制：（1）抗生素在细菌中作用的目标位置发生了变化。例如蛋白质合成抑制剂链霉素的抗性通常是由于细菌合成了一种变化了的核糖体蛋白质，这种蛋白质不再与链霉素相连，因此阻止了链霉素的抑制行为；（2）组织药物进入细胞。如对四环素的抗性是由于细菌合成了阻止四环素进入细胞的膜蛋白，因而四环素的穿透性大为减低所致；（3）改变或钝化药物。比如，对青霉素的抗性通常是由于β-丙酰胺酶的分泌，这种酶可切割和钝化抗生素。 抑制细胞生长的最低抗生素浓度称为最小抑制浓度（MIC）。对许多抑菌的抗生素如四环素而言，当培养基中抗生素浓度接近MIC时，细菌菌落变得很小。 3. 细菌细胞的生长 在最佳生长条件下，细菌以每20min分裂一次的速度进行繁殖。然而，这种速度仅能维持很短的一段时间。当细菌被接种到新鲜培养基上，它们通常经历下面4个时期：滞留适应期、对数生长期、最高生长期和衰亡期。在对数生长期中，细菌以最大速度进行生长和繁殖。大多数重组DNA实验都是在细菌处于对数生长期进行的。 第二部分 实验操作 一．LB培养基的配制 LB液体培养基： 配制1L： 胰化蛋白胨（Proteose peptone） 10g 酵母提取物（Yeast extract powder） 5g Nacl 10g 上述量的药品溶于900ml水中，至完全溶解后，用5M或10M NaOH调PH值至7.0，定容至1L，15 lbf/in2(1.034×105Pa)高压下灭菌20min。 LB固体培养基500ml： 500ml的LB液体培养基中加入7.5g琼脂粉，100ml的LB液体培养基中加入1.5g琼脂粉。15 lbf/in2(1.034×105Pa)高压下灭菌20 所需灭菌的器皿或试剂 LB液体培养基，LB固体培养基，蒸馏水，牙签，空三角瓶，过滤器，离心管，枪头， 40%甘油，培养皿 二．大肠杆菌单菌落的制作和细菌培养 1. 倒平板 在无菌条件下，将溶化的LB固体培养基轻轻倒入培养皿（直径为9cm）中，每100ml培养基大约可倒5个平板，即每个平板需要20ml 本实验中培养含有Prok2的大肠杆菌需要加入终浓度为50ug/ml的卡那霉素（Kan），则100ml的固体或液体培养基中需要加入50ul浓度为100ug/ul的卡那霉素。 注意：加抗生素时，培养基不可太热，否则，抗生素失活，以握住不烫手为准。 2. 划单菌落 无菌条件下，待平板凝固后，用接种环蘸取少量菌液，在平板上划“Z”形线，注意不要重叠或交叉，然后盖好培养皿，用封口膜封好，37℃过夜培养15h 3. 细菌培养 无菌条件下，用已灭菌的牙签挑取一单菌落，转入4-5ml含有（或不含）相应抗生素的LB液体培养基中。37℃过夜培养15h左右。 实验二 细菌的保存和大肠杆菌质粒DNA的提取 第一部分 理论知识 一．基因工程载体的特性 基因工程中的载体应具有如下一些特性： Ⅰ.能在宿主细胞内进行独立和