分子生物学实验技术 .pptx

分子生物学实验目 录实验一、植物染色体DNA的提取及纯度鉴定实验二、大肠杆菌质粒DNA的提取实验三、琼脂糖凝胶电泳实验四、ＤＮＡ的限制性酶切实验五、大肠杆菌感受态细胞的制备及外源DNA的转化实验六、PCR基因扩增技术实验一、植物染色体DNA的提取 及纯度鉴定一、实验目的掌握真核植物基因组染色体DNA的一种提取方法学习使用紫外分光光度法鉴定DNA的纯度，估计相对含量。二、实验原理用低温机械研磨和高浓度、SDS等破坏细胞壁及膜，使蛋白变性使DNA与蛋白分离，用一定浓度的溶液将DNA提取出来，用高浓度乙醇沉淀DNA，氯仿/异戊醇等去除杂质，RN ase降解核酸，得到纯度较高的DNA样品。根据核酸与蛋白质分别在OD260和OD280有吸收峰分别测定之，比较OD260/OD280比值在1.8附近程度估计纯度，依据经验公式计算DNA含量。三、实验材料与试剂物品1.材料香椿（Toona sinensis）黄花苗2、试剂提取缓冲液（预冷）SSCRNase液9、我们的市场行为主要的导向因素，第一个是市场需求的导向，第二个是技术进步的导向，第三大导向是竞争对手的行为导向。10、市场销售中最重要的字就是“问”。11、现今，每个人都在谈论着创意，坦白讲，我害怕我们会假创意之名犯下一切过失。12、在购买时，你可以用任何语言；但在销售时，你必须使用购买者的语言。13、He who seize the right moment, is the right man.谁把握机遇，谁就心想事成。14、市场营销观念：目标市场，顾客需求，协调市场营销，通过满足消费者需求来创造利润。15、我就像一个厨师，喜欢品尝食物。如果不好吃，我就不要它。16、我总是站在顾客的角度看待即将推出的产品或服务，因为我就是顾客。17、利人为利已的根基，市场营销上老是为自己着想，而不顾及到他人，他人也不会顾及你。3、仪器设备高速冷冻离心机（8-316）制冰机（8-312）紫外可见分光计（8-316）冰箱（-86度在8-312，-20度，4度在8-312）水浴锅电子天平玻璃仪器等四、实验操作流程采摘芽苗，洗净→剪小段，擦干表面水分→放-86度冰箱冻30分钟以上→冰浴研磨匀浆（分次加提取液）→以下见讲义五、结果与处理纯度含量思考题：影响本实验结果的因素有哪些，要得到高纯度的DNA需要在实验中注意哪些问题？实验二、大肠杆菌质粒DNA的提取目的与要求 通过质粒的一些特性、质粒DNA的提取、测定，学习用碱变性法提取质粒DNA的方法，了解用分光光度计测定DNA含量的方法。2. 相关知识及原理质粒(Plasmid) ：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。DNA超螺旋结构常用的质粒载体是通过DNA重组技术构建而成的。pUC18, pUC19(500~700细菌质粒: 细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1Kb-200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶系。 质粒类型：严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。载体(Vector)：用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的质粒(运载工具)。具备的条件：易于鉴定；在受体细胞中可以独立复制；易于筛选；易于导入受体细胞。EcoRIInsert1.9kbXhoI载体的结构：抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene)启始复制子（ori, Origin of replication)；多克隆位点(MSC, Multiple cloning site or polylinker)；标记基因(Marker gene, such as LacZ gene)。　　Ampr抗性基因Ampr抗性基因编码一种周质酶（β-内酰胺酶）可特异地切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力　二、实验原理 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们，在碱性PH，DNA变性，恢复中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA