江大发酵工程课件.pptx

微生物遗传育种;第三章 突变的应用 ;第一节???诱变育种;一、概述;（二）诱变育种技术在育种工作的作用;（三）高产菌株诱变育种的特点;二、诱变育种方案的设计;三、诱变育种的一般步骤;（一）出发菌株的选择;（一）出发菌株的选择;（二）前培养;（二）前培养;（三）菌悬液的制备 ;（四）诱变处理 ;2.诱变剂量的选择 高产菌株在低剂量时效果较好，而对多核细胞、孢子、低产菌株或质量性状处理剂量不宜过低。 经多次诱变处理已钝化的菌株可用一次高剂量处理来激活；一次较高剂量的强诱变后，通常接着进行2~3次较低剂量的温和诱变，以利于菌株遗传性状的稳定。 在一次诱变中，可以分别采用不同剂量处理出发菌株，从中选出最佳剂量 诱变剂量的控制方法 化学诱变剂：诱变剂的浓度、处理时间和处理条件；物理诱变剂：照射距离、照射时间和照射条件;;;3. 处理方法 单一诱变剂处理; 复合处理：两种或两种以上诱变剂同时处理、不同的诱变剂交替处理、同一诱变剂连续处理以及紫外线与光复活交替处理等( 注意！);3. 处理方法 直接处理：在缓冲液或无菌生理盐水体系中对出发菌株进行诱变处理，然后涂平板分离突变株； 生长过程处理：在摇瓶培养基或固体平板中加入诱变剂，在菌体生长时进行诱变处理。（适用？）;（五）后培养 ;（六）变异菌株的分离及筛选 ;2.筛选：包括初筛，复筛和终筛等。 明确筛选目标：产量突变还是其它突变型；产量准备提高多少等； 一次诱变目标不要太高。 制定筛选方案：筛选准备分几步；筛选采用的培养方法和培养条件；每一步准备筛选多少菌株；每一步准备采用的分析方法等。;制定筛选方案时的一些基本原则;筛选的一般步骤;四、诱变育种工作中应注意的问题;要养成良好的工作习惯：如仔细观察细微的形态变化、要详实记录菌株的诱变史和诱变谱系。 诱变育种技术要和其他育种手段相结合。 诱变育种由于其筛选的盲目性，突变的不定向性，工作量十分大，因此要对整个工作进行合理的设计并结合新技术提高其工作效率。 ;第二节??营养缺陷型突变株的筛选与应用;一、营养缺陷型及其应用;完全培养基（Complete Medium，CM）含有满足某微生物的所有营养缺陷型和野生型菌株生长所需营养物质的天然或半合成培养基。 基本培养基（Minimal Medium，MM）：不含生长因子仅能满足某微生物的野生型菌株生长需要的最低成分合成培养基。 补充培养基（Supplemented Medium，SM）：补充了一种或数种生长因子，以满足某微生物的特定的营养缺陷型生长的培养基，其中的生长因子多是通过直接添加AA、碱基或维生素而提供。;与营养要求有关的三种遗传型;营养缺陷型突变株的应用 ;阻断代谢途径，积累中间代谢产物 例：利用谷氨酸棒杆菌的精氨酸缺陷型积累鸟氨酸 ;阻断分支代谢，积累另一终端代谢产物 例：利用XMP- 生产 AMP;高丝氨酸脱氢酶;应用渗漏突变株进行代谢调控育种 渗漏突变株（leakage mutant）：一种遗传障碍不完全的营养缺陷型，其特点是酶的活力下降但不完全丧失，使其能少量合成某一代谢产物，但产物的量又不造成反馈抑制。 优点：不需要限量添加生长因子。 筛选： 营养缺陷型突变株→诱变→ 挑选在MM上生长缓慢且菌落小的回复突变株;不同类型突变株积累L-赖氨酸的水平;二、营养缺陷型的筛选; NO！！！ 突变率低，筛选工作量会很大！ 营养缺陷型突变株无法在选择培养基上直接检出。 因此，需要淘汰野生型，即降低野生型细胞的数量和比例，使营养缺陷型细胞得以相对浓缩。 如何进行？ ;策略一：扶弱 创造营养缺陷型生长而野生型不能生长的培养条件 可行？ NO! 在所有培养基中营养缺陷型都没有生长优势！;策略二：除强 限制营养成分，使营养缺陷型细胞生长受抑制，野生型细胞在生长过程中被杀死或生长后被除去。 可行？ Yes！ 哪些方法？;淘汰野生型的方法;是否可以在后培养后直接淘汰野生型？ NO！ 由于后培养在CM中进行，细胞内可能存在内源氮源，在淘汰野生型时营养缺陷型也会生长而被误杀，因此在淘汰野生型前要先进行饥饿培养！！！ 淘汰野生型时还应该注意哪些问题？ 在此过程中营养缺陷型不能得到相应的营养而生长！ 野生型细胞破裂释放：高渗培养基；控制培养时间 野生型细胞代谢调控不严密而释放;抗生素淘汰野生型;检出缺陷型;夹层培养法 制备琼脂平板 培养：长出菌落后作记号 加第四层培养基：CM 培养：新长出的菌落多为缺陷型。;逐个检出法 分离得单菌落：CM 点种：逐个菌落依次点种至MM和CM上 培养：在MM上不长、CM上长的菌落为缺陷型 ;影印培养法 分离单菌落：CM 影印：用“印章”影