PCR反应中基本成分(引物、dNTP、模.docxVIP

PAGE PAGE #/3 1、引物 弓物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于弓曲与模板DNA互 补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核首 酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则： 引物长度：15-30bp,常用为20bp左右。 引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多 易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的瞟吟或唸口定核昔酸的成串 排列。 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是 3,端的互 补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 引物3,端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避 免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位 点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。 0Q⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物 :每条引物的浓度?lumol或10?100pmol，以最低引物量产生所需要的结 果为 好，弓物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机 会。 0Q 2、酶 目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另 一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR反应约需酶量（指总 反应体积为100ul时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减 少。 3、dNTP dNTP的质量与浓度和PCRT增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状,如保存不 当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到?，小量分装，-20C冰冻保存。 多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50?200umol/L,尤 其是注意 4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时 （偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与 Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。 dNTP储存液：dNTP溶于pH为的NaOH贮存液中，最初的贮存液可稀释到 10mol/L，分装后存放在-20C冰箱中。dNTP使用浓度在20?200卩mol/之间。4种 dNTP?必须等浓度配合以减少错配误差。dNTP使用浓度：在PCF反应中，使用低 dNTP浓度,?可减少非靶位置启动和延伸时的核昔酸错误掺入。一般可根据靶序列的 长度和组成来决定最低dNTP浓度。例如在100卩I?勺反应体系中,4种dNTP的浓 度为20卩mol/L可基本满足合成卩g DNA或?10pmol/L?的400bp序列。使用低 dNTP浓度侮种dNTP浓度为2卩mol/L）能够高度灵敏地⑺?扩增ras基因 点突变的 等位基因。 4、模板 模板核酸的量与纯化程度，是PCF成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯 化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS勺主要功能是：溶解 细胞膜 上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋 白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核 酸。提取的核酸即可作为模板用于 PCR反应。 一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去 染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCF扩增。RNA模板提取一般采用异硫氤 酸弧或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。 5、Mg2+浓度 Mg2+对PCRT增的特异性和产量有显著的影响，在一般的 PCF反应中，各 种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为?L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性 降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减 少。 弓I物是PCR特异性反应的关键，不好的引物严重影响实验的质量，好的引物 可以事倍功半；酶的选择一般是看实验的目的，例如克隆长片段，可能就需要高保真 的聚合酶；dNTP浓度和Mg2+浓度高了会影响PCF反应特异性。DNA模板 中还有 蛋白质也会严总影响PCF质量，因此上述5个基本成分质量和浓度必须 合理。