人胰岛素的制备.docx

人胰岛素的制备 一、 获得目的基因 从供体细胞中提取 mRNA，以其为模板，在反转录酶的作用下，反转录合成 胰岛素 mRNA互补 DNA， 再以 cDNA第一链为模板，在反转录酶或 DNA聚合酶 I 的 作用在，最终合成编码它的双链 DNA序列。即得到了目的基因。 反转录 - 聚合酶链反应法 ( 一)从人体细胞内提取胰岛素基因转录的 mRNA 1, 细胞总 RNA的提取 : 取胰岛 B 细胞，用 PBS洗后，加入 TRIZOL试将细胞破裂，后用 DEPC处理， 多次离心后，取 RNA白色沉淀，测 OD值，电泳。 2 ，从总 RNA中分离 mRNA： 取上述提取的总 RNA若干，加入 Buffer OBB ， Oligotex Suspension ，打 匀。 70 ℃水浴（裂解 RNA的二级结构） ， 20-30 ℃条件下，静置（让 Oligotex 与 mRNA结合）。 将 Oligotex/mRNA 复合物的沉淀加到 EP管 SPIN 柱上高速离心， 加 Buffer 将其他 RNA洗脱，最后用琼脂糖凝胶电泳纯化 mRN。A （二） mRNA转录合成 cDNA第一链 cone 第一链的合成 加入上步获得的 mRNA和适当引物于 EP 管中，加入 RNase-free water ，混 匀后,70 ℃反应 10 分钟，反应完成后 , 立刻将反应体系置于冰上 5min; 稍微离心 一下 , 顺序加入缓冲液、 RNA 酶抑制剂、反转录酶、 dNTP （加入放射性同位素 利于检验） ， 混匀，稍微离心反应物之后 ,42 ℃放置 2 分钟。取出置于冰上。 电泳分析，同位素活性测定。 （三） PCR法扩增，特异合成目的 通过胰岛素的特异引物，用 链。 链 PCR法的操作步骤： 预变性 引物退火 引物延伸 循环 25-35 次 最后延伸 cDNA链 PCR法进行扩增，特异的合成胰岛素的 cDNA 前端引物： 5’-ggt tcc gga tct ggt tct ggt tct ctg gtc ccc cgc ggt agt cac cac cac cac cac cac cgt ttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc- 后端引物： 5’-agt gtc gac tta gtt gca gta gtt ctc cag ctg gta- 3’ 3’ 二、 组建重组质粒 采用 pQE--30 质粒作为载体，用双酶切法进行基因重组。 １ . 双酶切法 用两种酶限制性内切核酸酸消化载体 DNA和外源 DNA片段， 使载体和外源目 的基因的两端分别形成不同黏性末端， 将它们混合， 在连接酶的作用下相同的黏 性末端可退火连接成重组 DNA分子，从而实现 DNA的定向连接。 ２ . 重组过程 pQE--30 用 Hind Ⅲ和 BamHⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳分离、回收纯化酶切片 段。 外源 DNA片段同样也用 Hind Ⅲ和 BamHⅠ酶切并回收纯化酶切片段。 双酶切 后的载体外源 DNA片段混合退火， 因为 Hind Ⅲ和 BamHⅠ的黏性末端不匹配， 避 免了载体和外源 DNA片段的自身连接，外源 DNA片段只能定向地连接到载体的 Hind Ⅲ和 BamHⅠ位点之间。 当然也不可避免发生载体的 Hind 性末端之间的两个碱基互补形成开环， 转到大肠杆菌中被修复， 占少数，是低效转化。 三、构建基因工程菌 Ⅲ和 BamHⅠ的黏 但这样的重组子 ( 一) 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建 A 链和 B 链同时表达法 将人胰岛素的 A 链和 B 链编码序列拼接在一起，然后组装在大肠杆菌 - 半乳 糖苷酶基因的下游。重组子表达出的融合蛋白经 CNBr处理后，分离纯化 A-B 链 多肽，然后再根据两条链连接处的氨基酸残基性质，采用相应的裂解方法获得 链和 B 链肽段，最终通过体外化学折叠制备具有活性的重组人胰岛素。重组 的转化 1, CaCl2 法制备大肠杆菌感受态细胞 ： A DNA 取 100 ml 菌体培养至 OD600= 0.5 ，离心收集菌体，用 10 ml 冰冷的 10 mM CaCl2 溶液悬浮菌体，离心，收集菌体，用 1 ml 冰冷的 75 mM CaCl2溶液悬浮