第11章基因工程-PowerPoint演示文稿.pptx

第 11章 基因工程;遗传工程（genetic engineering），也称生物工程，利用工程技术的方法改造和修饰生物体，使其产生新的性状或产品，从而改良生物体的一种遗传学手段。 核心是利用重组DNA技术，在分子水平上操作修饰改变生物体。 细胞工程（cell engineering） 基因工程（gene engineering） 酶工程（enzyme engineering） 发酵工程（fermentation engineering）;基因工程（gene engineering） 利用人工的方法把生物的遗传物质在体外进行切割、拼接和重组，获得重组DNA分子，然后导入宿主细胞或个体，使受体的遗传特性得到修饰或改变的过程。 基因工程操作的对象是DNA分子，首先把目标基因克隆出来插入到一定的载体中，然后将重组DNA分子导入到受体细胞，并使其保持和遗传下去。 ;目的基因的获 目的基因与载体的连接成重组DNA分子 重组DNA分子导入受体细胞 筛选重组克隆 基因表达与产物分离;第 2节 基因的分离;第 2节 基因的分离;（一）限制性内切核酸酶;★限制酶可分为3类。 Ⅰ型酶：只有EcoB和EcoK两种，具有催化限制性切割和修饰核苷酸2种功能。 Ⅱ型酶：在遗传工程中应用最广泛。① 有特异识别和切割的序列部位，被切割的DNA分子形成单链的断裂；② 断裂的部位通常不是直接相对的，结果所形成的DNA片段常具有碱基互补的单链尾巴（粘性末端），使其能够重新连接； ③ 内切酶的切割和修饰功能由两个不同的酶催化所完成。 Ⅲ型酶具有特异的识别位点，这种识别位点是非对称的。;;;;;;（四） PCR;（四） PCR;二 载体 ;（一） 质粒 ;（一） 质粒 ;筛选的原理是：细菌细胞含有野生质粒，在含有X-gal（5-溴-氯吲哚-半乳糖苷酶）的培养基上培养时产生兰色菌斑；插入克隆片段后，lacZ基因失去功能，不能代谢X-gal，从而产生白色菌斑。;（二） 病毒载体;（二） 病毒载体;(三 ) 克隆大片段载体;与噬菌体载体和质粒载体相比具有多个优点： 具有cos位点，能高效地转化大肠杆菌，能在大肠杆菌中实现自身环化，并能在大肠杆菌中复制； 有像质粒一样的选择标记； cosmid载体比较小，但能插入较大的外源片段，可克隆外源片段的长度在15~45 kb之间。 由于cosmid载体的大片段克隆能力，多用于基因组文库的构建，而λ噬菌体载体多用于cDNA文库的构建。已有多种粘粒载体可用于基因克隆，pJB8是最常用的粘粒载体之一;细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC） ;酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）;三 基因分离方法;1 构建基因文库 基因文库(library)是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体。从基因文库中分离基因，首先要构建基因文库。只有利用合乎要求的基因文库才有可能筛选出所需要的基因，很多分子遗传学工作才能继续深入下去。 ;核基因文库 ◆核基因文库(genomic library或genomic bank)是将某一生物的全部基因组DNA酶切后与载体连接构建而成的。 ◆通常的方法是，尽量提取大分子量的核DNA，用限制性酶酶切后，分离选择具有一定长度(大于15kb)的DNA片段，与适宜的载体连接构成重组DNA分子, 选择相应的宿主细胞用于克隆。载体可以是质粒，噬菌体，BAC或YAC等 ;◆理想的核基因文库应当能包括全部的基因组序列。如果每一个克隆包括的DNA片段大，则总克隆数目少，常选择能接受较大片段的载体。 ◆检测是否包括一个完整的基因组序列的公式： ???????????? ◆例:人类基因组3.0x106kb, 以λEMBL作载体，插入片段的平均长度为17 kb，p为99%时, 基因库应有8.1x105 个 重组噬菌体。 ;染色体基因库 ;cDNA库 ;◆ cDNA库仅具有用于分离mRNA的细胞或组织内表达的基因的mRNA序列，仅包括基因组的部分基因序列。 ◆构建什么样的基因库取决于研究目的。cDNA 库对于研究基因的表达模式、分离某一特定基因是十分有用的。如分离在某一细胞或组织高效表达的某种基因。 ◆通常是将cDNA库与核基因库配合使用，以便既能得到基因的编码序列，又可得到基因的调控序列。 ;2 筛选基因库 ;◆将重组噬菌体(来自基因库)感染的宿主细菌细胞与少量培养基混合培养，噬菌体在宿主细胞内复制扩增后形成噬菌斑。 ◆将培养皿中的噬菌斑转到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，变性，用标记的探针与膜上的噬菌体DNA杂交，杂交膜用X-光片放射自显影，检测杂交信号。 ◆与探针杂交的噬菌斑即