微生物的革兰氏染色实验报告.pdf

一、实验题目：微生物的革兰氏染色 二、实验目的： 1、学习并初步掌握革兰氏染色法； 2、了解革兰氏染色的原理； 3、巩固显微镜的使用。 三、实验原理： 革兰氏染色是 1884 年丹麦病理学家 Christain Gram 氏创立的，是细菌学中最重要的鉴 别染色法。染色步骤分为四个部分： 1、初染：加入碱性染料结晶紫固定细菌图片； 2、媒染：加入碘液，碘与结晶紫形成一种不溶于水的复合物； 3、脱色：利用有机溶剂乙醇或丙酮进行脱色； 4、复染：复红配成碳酸复红作为复染剂。 成分 占细胞壁干重的 % 革兰氏阳性细菌 革兰氏阴性细菌 肽聚糖 含量很高（ 50~90 ） 含量很低（ ~10 ） 磷壁酸 含量较高（ 50 ） 无 类脂质 一般无（ 2 ） 含量较高（ ~20 ） 蛋白质 无 含量较高 G-和 G+ 细胞壁的比较： 1、阳性（ G+ ）菌细胞壁特点：细胞壁厚，只有一层，主要由肽聚糖构成，肽聚糖含量 高，结构紧密，脂类含量低。当乙醇脱色时，细胞壁肽聚糖层孔径变小，通透性降低，结晶 紫和碘的复合物被保留在细胞壁内，复染后仍显紫色（如芽孢杆菌） 。 2、阴性（ G- ）菌细胞壁特点：细胞壁薄，由两层构成，内壁层和外壁层，细胞壁中脂 类中脂类物质含量较高， 肽聚糖含量较低， 网状结构交联程度低， 乙醇脱色时溶解了脂类物 质，通透性增强， 结晶紫与碘的复合物易被乙醇抽提出来， 因此， 革兰氏阴性菌细胞被脱色， 当复染时，脱掉紫色的细胞的细胞壁又着上红色（例如大肠杆菌） 。 四、实验器材： 1、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。 2、溶液和试剂：革兰氏染液、草酸铵结晶紫染液、碘液、 95% 乙醇、番红复染液、水。 3、仪器及其他用品：酒精灯、载玻片、显微镜、接种环、试管架、滤纸、滴管。 五、实验步骤： 1、取一个载玻片，将其洗净并沿一个方向擦拭干净，直至液体不再其上收缩为止；将 接种环整平， 用灼烧过的接种环在混匀的菌种中取菌， 按常规方法图片， 应涂大， 不宜过厚。 2、打开酒精灯，用火焰固定，不宜烤得太狠，否则菌种呈假阳性。 3、轻旋结晶紫染液滴管，将其旋出，滴加 1 滴草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位（轻晃 使其完全覆盖） ，染色 40s 。 4、染色完成后倾去染液，水洗至流出水为无色。 5、将玻片上残留水用滤纸吸去，待其干燥。 6、在涂菌部位滴加碘液，覆盖 1min 。 7、媒染完成后，倾去碘液，水洗至流出水无色。 8、将玻片上残留水用滤纸吸去，待其干燥。 9、将载玻片放在白色笔记本上，用滴管滴加 95% 乙醇脱色，脱色 30~40s ，不宜脱色太 狠，否则菌种呈假阴性。 10、脱色完成后立即用水洗去乙醇。 11、将玻片上残留水用滤纸吸去，待其干燥。 12、滴加番红复染液，染色 4min 。 13、染色完成后，水洗至流出水无色。 14、吸去残留水并晾干。 15、用显微镜观察并绘图。 用以上步骤完成：大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的混合图片染色、大肠杆菌单独菌种染色、 金黄色葡萄球菌单独菌种染色。 六、注意事项： 1、选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会