荧光定量PCR之绝对定量解析计划——标准曲线绘制.docx

荧光定量PCR之绝对定量解析计划——标准曲线的绘制 荧光定量PCR之绝对定量解析计划——标准曲线的绘制 PAGE / NUMPAGES 荧光定量PCR之绝对定量解析计划——标准曲线的绘制 荧光定量 PCR之绝对定量分析——标准曲线的绘制 绝对定量定义 绝对定量是用浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量。 将标准品稀释至不同浓度，作为模板进行 PCR反响。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的 CT值为纵坐标，绘制标准曲线，对未知样品进行定量时，根据未知样品的 CT值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。 Log( 起始浓度 ) 与循环数呈线性关系， 通过起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，即得到该扩增反响存在的线性关系 由样品 CT值，就可以计算出样品中所含的模板量 绝对定量标准品标准品的一些标准 * 必须用与扩增目的基因相同的引物进行扩增，并且扩增效率相同 * 标准品必须是经过准确定量的〔我们通常用的是 ASP-3700紫外光 / 可见光微量分光光度计〕 标准品必须是标准化的〔例如，同一化的细胞数〕 在每组实验时，必须用相同的阈值设定来确定 CT值 标准品可以是含有目的基因的线性化的质粒DNA，也可以是比扩增片 段长的纯化后的 PCR产物，当然也可以是基因组 DNA，甚至 cDNA，但前提是所有的作为标准品的核酸都必须保证稳定。 标准品的制备 一般一条标准曲线取四到五个点，浓度范围要能覆盖样品的浓度区间，以保 证定量的准确性。 一般一个点重复三至五次， 对于常期稳定使用的标准品可以适 当减少重复的次数。 倍比梯度稀释方法： 1v 原液〔标准品 i 〕 +9v 稀释缓冲液，得标准品 ii 1v 标准品 ii+9v 稀释缓冲液，得标准品 iii 1v 标准品 iii+9v 稀释缓冲液，得标准品 iv 1v 标准品 iv+9v 稀释缓冲液，得标准品 v 依次倍比稀释 拷贝数的计算： 详见核酸拷贝数的计算 实例 标准品的制作：将标准品依次进行 10 倍稀释，ASP-3700 测得其拷贝数× 108copy /ul 标准曲线的绘制〔 1cycle=1min 〕 设置对照：浓度为× 107、× 106、× 105、× 104、× 103、× 102、× 101 的标准样品各一个，设空白对照 PCR反响：以不同浓度标准品作为模板 标准品的扩增曲线 标准品的溶解曲线 标准品的标准曲线图 X Log 7 6 5 4 3 2 1 Y CT值 增效率〔 E〕 算： E=10-1/ 斜率 =10-1/ =，E%=×100%=104% 假设未知 本的 CT ，将 CT 代入 性方程： 即 =，所以 X= copies 核酸拷 数的 算 一、分步推理如何 算核酸拷 数 1A260吸光度 =dsDNA 50ug/ml=ssDNA 33ug/ml=ssRNA 40ug/ml 核酸 度＝ (OD260)× (dilution factor) ×[33 或 40 或 50]=ng/ul MW代表 克 / 摩 ， 位 dolton ：1dolton 即表示 1g/mol 1 摩 =摩 分子 ( 拷 数 ) 平均分子量 (MW)：dsDNA=(碱基数 ) ×(660 道 / 碱基 ) ssDNA =( 碱基数) × (330 道 / 碱 基 ) ssRNA=(碱基数 ) ×(340 道 /碱基) 得到拷 数 算公式：拷 数 / 摩 ) × ( 度 )/(MW g/mol)= copies/ml. 即× (g/ml)/(DNA length ×660)=copies/ml. 或× 1023) ×(ng/ul ×10-9 )/(DNA length ×660)=copies/ul. 例： 3000 碱基 粒， 度 100 ng/ul MW=3000bp× 660dalton/bp= ×106daltons ，即 1mol=×106g (100ng ×10-9 )g/ ×106＝摩 数 copy 数＝摩 数×× 1023＝3×1010copies/ul. 二、 是一个小小的 算器，使你 算更加方便快捷，免去算数之苦??什么是拷 数 如何 算拷 数 算方法：× 1023 拷 数 / 摩 ) × ( 度 g/ml) / (MW g/mol) = copies/ml [ 平均分子量 (MW g/mol) ：dsDNA=(碱基数 ) × (660 道 / 碱基 ) ；ssDNA=(碱基数 ) × (330 道 / 碱基 ) ； ssRNA=(碱基数 ) ×(340 道 / 碱基 )]