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荧光PCR检测原理 荧光PCR检测原理 PAGE / NUMPAGES 荧光PCR检测原理 实时荧光定量 PCR 技术是指在 PCR 反响体系中参加荧光染料或荧光基团，利用荧光信号来实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析。 其特点有： 用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量，进行实时动态连续的荧光监测，防止终点定 量的不准确性， 并且消除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程。 荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或荧光探针特异结合木得检测物等方法获得，打打 提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。 Real-time O-PCR 可以应用 于 mRNA表达的研究、 DNA 拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定、细胞因子的表达分析、肿瘤耐药基因表达的研究以及病毒感染的定量监测。 实时荧光定量 PCR 技术的根本原理 在 PCR反响体系中参加荧光染料或荧光基团，这些荧光物质有其特定的波 长。仪器可以自动检出，利用荧光信号积累，实时监测整个 PCR 进程，在 PCR 循环中，测量的 信号将作为荧光阈值的坐标。 并且引入一个 —— Ct 值〔 Threshold cycle 〕概念， Ct 值是指产生可被检测到得荧光信号所需的最小循环数， 是在 PCR 循环过程中 荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。 荧光阈值相当于基线荧光信号的平均信号标准偏差的 10 倍。一般认为在荧光阈 值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号，可以用于定义一个样本的 Ct 值。 通常用不同浓度的标准样品的 Ct 值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。 方程式的斜度可以用来检查 PCR 的效率，所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数〔 R2＞ 0.99 〕，这样才能认为实验的过程和数据是可信的，使用这个方程式计算出未知样本的初始模板量。 实时荧光定量 PCR 仪都有软件，可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。 实时荧光定量 PCR 技术的应用 基因工程研究领域 ① 基因表达研究：对 β 地中海贫血症患者 β 与 γ 珠蛋白 mRNA水平进行检测，其结果特异性强、 定量准确，为了解 β 地中海贫血的分子病理机制及其临床诊断提供了可靠的检测数据。 ② 转基因研究：利用两种发光探针及适当的循环阈值，扩增一个转移后的基 因和一个对照基因，以分析转基因老鼠接合性。该方法为 45 个转基因动物的同型结合及异质 结合提供了明确的鉴定结果。 通过实时定量 PCR 检测，同型结合的异质接合动物交配后其子 代中转基因的传递情况符合孟德尔遗传规律。 这项技术在转基因动物繁育及基因剂量功能效 应实验中将有很大的用途。 ③ 单核苷酸多态性 〔 SNP〕及突变分析： 实时荧光定量 PCR 一个诱人的应用前景是用于检测 基于两条探针和基因组的不稳定性。 基因突变基于两条探针， 一条探针横跨突变点， 另一条 为锚定探针， 与无突变位点的靶序列杂交。 两条探针用两种不同的发光基团标记。 如靶序列 中无突变， 探针杂交便完全配对， 如有突变，那么探针与靶序列不完全配对，会降低杂交体得稳定性，从而降低其熔解温度〔 Tm〕。这样便可对突变和多态性进行分析。 医学研究领域 ① 病原体检测：由于实时荧光定量 PCR方法可靠性和重复性好，并且操作简 便、快速、结果判断客观， 目前，人们用此方法对人类免疫缺陷病毒、 肝炎病毒、结核杆菌、 巨细胞病毒、 EB 病毒、流感病毒 A 、流感病毒 B 等病原体的检测。荧光定量 PCR 问世后的几年中，积累了大量有关病原体核酸量与感染性疾病发 生、开展和预后之间关系的资料， 这些研究资料不断丰富， 将形成感染性疾病的临床分子诊 断标准。 ② 药物疗效考核：利用实时荧光定量 PCR 技术检测临床样品中与抗药性相关的基因的表达。结果证明，实时荧光定量 PCR 系统是定量检测抗药基因表达的可靠方法，应用这种技术可以预测化疗将引起的反响。 ③ 肿瘤基因检测：肿瘤的本质是细胞内基因发生了变化，是一种多基因异常 的疾病，这些异常变化用实时荧光定量 PCR方法都可以检测出来。 目前用此方法进行过端粒酶 hTERT基因、慢性粒细胞性白血病 bcr/abl 融合基因、肿瘤 MDRI 基因、白血病 WTI 基因、肿 瘤 ER 基因、前列腺癌 PSM基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测。 随着与肿瘤相 关的新基因的不断发现。荧光定量 PCR 技术将会在肿瘤的研究中发挥更大的作用。 其他领域 用实时荧光定量 PCR方法对免疫组分进行分析是其应用的重要方面。 所谓实时荧光定量 PCR 技术 ，是指在 PCR 反响体系中参加荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线