His-Tag表达蛋白纯化原理.pdf

His-Tag 表达蛋白纯化原理 组氨酸标签蛋白的纯化 His-Tag 融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟， 它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表 达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲 和色谱去（ IMAC ）纯化。 2 ．1 IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography) 是 Porath et al.1975 年用固定 IDA 作为配基的填料螯合过渡金属铜、 镍、 钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨 酸残基的蛋白， 1987 年 Smith et al. 发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属 离子的 IDA-sephadex G-25 作用力更强，此前在 1986 年他和他的合作者用 Ni2+-IDA-sephadex G-25 亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。同 年 1987 年 Hochuli et al. 发现带有相连组氨酸的多肽和 Ni2+-NTA 填料作用力更强 于普通的肽， 1988 年他第一次用这样的方法纯化了带六个 组氨酸标签的多肽，无论是在天 然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达 带六个组氨酸标签的蛋白配合 IMAC 变得非常普遍，相对而 言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以 表达带六个组氨酸标签的蛋白配合 IMAC 纯化变成最常用而 且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。 1986 年 Porath et al. 还发现 Fe3+-IDA-sephadex G-25 可以用于磷酸化蛋白的纯化， 而后发现 Ga3+-IDA 也有 同样的效果，这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷 酸化多肽的富集和纯化，同时 IMAC 也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽，应用非 常广泛。 市面常见的商品化 IMAC 用于带六个组氨酸标签蛋白的配基 有以下几种： 2.2 影响 IMAC 纯化结果的因素： 2.2.1 填料的种类： 不同填料厂家的填料有差别，所以使用过程最好能得到厂家 的技术支持，因为不同的厂家填料不同，此外蛋白纯化个性 很强，没有哪一个填料是能适合所有带六个组氨酸标签蛋白 的纯化，载量高和特异性好本身就是矛盾。 2.2.2 填料的配基种类、密度、金属离子种类 填料最简单的判断是螯合好同样的金属离子，哪家产品的颜 色越深就意味着和蛋白的作用力越强，适用范围越广，载量 也越高，纯化的好坏关键看纯化的条件，仅有 填料的特异性是不够的， 同样配基密度下 IDA 填料的亲和力 要比 NTA 的强，所以 NTA 上不能吸附的样品可以选择 IDA 为配基的填料。 螯合金属离子和蛋白作用强弱为铜和镍离子的强，而锌和钴 离子的弱。因此如果一个蛋白作用力强，想得到好的特异性 可以选择螯合钴离子，它还有一个优点是不怕 还原剂，特别时候有高浓度的还原剂。相同金属离子， IDA 的强于 NTA 。螯合金属离子的价位越低和蛋白的作用力越强。 同时镍离子是最常用的，如果有条件可 以换不同金属离子以得到更好的效果，因为不同的金属离子 有不同的选择性。因此要希望填料应用范围广就选择镍琼脂 糖凝胶，如果是希望特异性好而且稳定就选择 镍 NTA 琼脂糖凝胶 .2.2.2 蛋白本身的结构和样品来源 IMAC 原理已经说明只要是带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残 基的蛋白都可以被吸附，所以要想得到好的纯化效果，必须 选择好纯化的条件，通常带组氨酸蛋白都