RNA提取标准流程.docxVIP

RNA提取标准流程 RNA提取标准流程 原理： TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol使样品细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中，取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA。 预防RNase污染注意事项： 1． 经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。 2． 使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。 3． RNA提取过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿、塑料制品高压灭菌，然后烘干即可。 4． 配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.05% v/v，充分混匀后37oC放置过夜，高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作。） RNA的提取 准备试剂：氯仿，异丙醇（可保存在-20oC，用时取出置于冰上），75%乙醇，无RNase的水。所有.溶液均需用0.05% DEPC处理过的水配制。10×Loading buffer（宝生物工程（大连）有限公司，货号：D603，35元，1mL×5支） 准备器材：1 mL、200 μL枪头、小烧杯*3、1.5 mL Eppendorf管、2 mL Eppe ndorf管若干、报纸、卷纸、研钵，以上物品全部需要高压。 操作步骤: 1. 研磨+匀浆：将组织在液氮中磨碎（大体积不均一的样品，如下丘脑、海马等神经组织、成年动物肾上腺等腺体，必须对整个组织研磨），取50～100 mg组 织样品（肝脏可减少样品量到30 mg）放入2 mL离心管中，称重记录；均一组织或者小体积的不均一组织可直接称重后匀浆。每50～100 mg组织加入1 mL TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10%。 2．将匀浆样品在室温（15～30oC）放置5 min（可延长到15 min），使核酸蛋白复合物完全分离。 可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖（如肝脏和肌肉中的糖原）或胞外 物质（肌肉）可于2～8℃ 10000 × g离心10 min，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量基因组DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液转入2 mL管中进行下一步操作。 3. 每1 mL TRIzol加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡60 s（可使用混匀器，也可手动剧烈颠倒混匀），室温放置3 min。（可延长震荡时间和放置时间到15 min，同GTC法） 4. 4oC 10000 × g离心15 min。样品分为三层：底层为红色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。（即1mL最多600μl，为保证RNA质量，可适量减少抽取量，防止抽到下层） 5. 记录抽取水相的量，把水相转移到新的1.5 mL Eppendorf管中，用等体积的预冷的异丙醇沉淀水相中的RNA。 a. 每使用1 mL TRIzol加入0.5 mL异丙醇，室温放置10 min。 b. 可选：应对糖原含量较高的组织（如肌肉和肝脏）：每使用1 mL TRIzol在水相中加0.25 mL异丙醇和0.25 mL高盐溶液（0.8 M柠檬酸钠和1.2 M NaCl）混合离心，这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，沉淀出RNA。 6. 4oC 10000 × g离心10 min，离心前看不出RNA沉淀（肌肉和肝脏等富含糖原的组织可能出现大量糖原沉淀），离心后在管侧和管底出现白色半透明状沉淀。弃上清。 8. 向1.5 mL Eppendorf管中加入75%乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1 mL TRIzol至少加1 mL 75%乙醇。4℃不超过7500×g离心5 min，弃上清。 9. 室温放置于超净台通风口（垫上已灭菌的吸水纸）干燥RNA沉淀，大约晾5～10 min即可，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入适量DEPC水，记录使用的DEPC水体积（适量是指加入水后仍能保证RNA浓度至少≥ 0.5 μg/μL，但不影响溶解，浓度在4 μg/μL以上的RNA较容易出现溶解不完全的情况），使之充分溶解（可选择4℃放置1 h以上或55～65oC水浴10 min），之后才可以进行测浓度、DNA污染的PCR验证、RNA变性电泳等后续操作。RNA应尽快转移至-70oC保存。 也可用100%的去离子甲酰胺溶解（用于northern的RNA可这样保存于-20