载体与宿主的选择.ppt

5.2 酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC） YAC载体应含有下列元件： 酵母染色体的端粒序列 酵母人造染色体的构建： pYAC4 CEN4 EcoRI URA3 TEL BamHI TEL ori Apr TRP1 ARS1 酵母染色体的复制子 酵母染色体的着丝粒序列 酵母系统的选择标记 大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的选择标记 YAC载体的装载量为350 - 400 kb 第六十三页，共83页。 3 噬菌体或病毒DNA 噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。 噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为： 高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞 自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增 第三十一页，共83页。 3.1 大肠杆菌的 l 噬菌体 3.1.1 l 噬菌体的生物学特性： 生物结构 l 噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体 l 噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成 l-DNA全长48502个核苷酸 l-DNA上至少有61个基因 第三十二页，共83页。 l 噬菌体生物学特性： 生物结构 5’ TCCAGCGGCGGGG 3’ 3’ CCCGCCGCTGGA 5’ COS COS cos 头部合成基因 尾部合成基因 溶菌控制基因 晚期控制基因 DNA合成控制基因 阻遏基因 早期控制基因 阻遏基因 重组基因 删除与整合基因 l - DNA 第三十三页，共83页。 l 噬菌体生物学特性： 感染周期 E.coli 吸附 LamB受体 注入 复制 包装 裂解 第三十四页，共83页。 l 噬菌体生物学特性： 感染周期 体内包装 100个左右的拷贝 包装范围为原DNA的75 - 105% 即 36 - 51 kb D A 第三十五页，共83页。 l 噬菌体生物学特性： 溶原状态 l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。整合主要由l-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于溶原状态 DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态 第三十六页，共83页。 3.1.2 l-DNA载体的构建： 野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体： 插入型载体 取代型载体 DNA大小是野生噬菌体的75-105%(37-51kb)，才能被包装成噬菌体 （1）缩短长度 第三十七页，共83页。 l-DNA载体的构建：缩短长度 插入型载体 体外包装 插入位点 体外包装 插入片段 载体长度 37 kb 插入片段大小： 0 - 14 kb （51 – 37） 第三十八页，共83页。 l-DNA载体的构建：缩短长度 取代型载体 体外包装 体外包装 插入片段 最小装载长度 10 kb （36 – 51） 载体长度 26 kb 插入片段 最大装载长度 25 kb 第三十九页，共83页。 （2） 删除重复的酶切位点 野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1 - 2个 同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点 除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶位点 第四十页，共83页。 （3） 加装选择标记 与质粒不同，野生型l-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是l-DNA克隆载体构建的重要内容 l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类： 免疫功能类标记 颜色反应类标记 第四十一页，共83页。 加装选择标记 imm434 imm434基因编码一种阻止l-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的l-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑； 当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活， l-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑 第四十二页，共83页。 加装选择标记 lacZ lacZ基因编码b-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到lacZ基因中，基