配子和胚胎的冷冻及复苏规范.ppt

四、冷冻的步骤 适应症 胚胎的选择 慢速冷冻 快速冷冻 第三十页，共48页。 胚胎冷冻的适应症 保存移植后剩余的胚胎 有OHSS危险患者的胚胎 接受赠卵 由于突发疾病或其它原因暂时不能移植 保存生育功能 第三十一页，共48页。 胚胎的选择 符合移植或冷冻标准的胚胎囊胚形成率48～51％， 不符合者囊胚形成率41.7％ (Fertil Steril 2000,74:495, hum reprod 1998,13:2869) 第三十二页，共48页。 胚胎的选择 (碎片） 组别 继续培养胚胎数 囊胚形成数 囊胚形成率％ ≤5％ 280 72 25.7 5≤20% 109 27 24.8 20≤50% 85 13 15.3 50% 53 6 11.3 合计 527 118 22.4 P0.01 第三十三页，共48页。 胚胎的选择 （细胞数） 细胞数 培养胚胎数 囊胚数 囊胚形成率％ 4 102 3 2.9 4~6 334 94 28.1 6 38 15 39.5 合计 474 112 23.6 P0.01 第三十四页，共48页。 配子和胚胎的冷冻及复苏规范 第一页，共48页。 冷冻是保存组织和细胞重要方法（低温医学） 体外培养1年 干冰－79℃ 数月 液氮－196℃ 永久保存 分子运动，生理生化反应停止，任何损伤也无法修复 自发突变率1％ 第二页，共48页。 一、冷冻对细胞的损伤(37 ℃ －196 ℃) 冷冻危险区（-15 ℃ — -50 ℃） 冰晶形成 溶液效应 渗性休克 保护剂毒性 寒冷 第三页，共48页。 冰晶形成特点 有结构六角形晶体 只与水分子结合，排除其它溶质 先形成冰核，同质成核－35℃－40℃，异质成核－10℃－15℃（过冷） 一旦冰核形成，冰晶迅速增大 密度变小，体积增大 第四页，共48页。 1. 冰晶形成及对细胞的损伤 体积增大产生压力，冰晶穿孔胞浆渗漏 细胞内物质分布改变 结晶只与水分子结合，排斥其它任何溶质，随着冰晶的增大，像犁一样将细胞的其它成分挤在狭小的空间，细胞内间隙缩小，细胞内成分相互接触，发生不正常反应 溶质浓度上升，结晶析出，PH变化，蛋白质可溶性降低，有害物质浓度升高 复苏后局部低渗，结晶的溶质不会再溶解 复苏气泡形成，冷冻速率快，气泡多而小，含碳酸盐严重 第五页，共48页。 2. 细胞外溶液效应 细胞悬浮在溶液中 慢速冷冻细胞外液结冰导致细胞外渗透压上升是细胞脱水的关键 脱水太慢，溶液浓度过高对细胞内蛋白有毒性，（脂蛋白变性，细胞达到最小体积以下） 第六页，共48页。 0.16M－5M O o o 第七页，共48页。 3. 渗性休克 复苏时细胞外冰融化造成低渗，细胞内渗透压高，细胞外水进入细胞内过快，细胞肿胀 第八页，共48页。 4. 渗性保护剂的毒性 溶液浓度，暴露时间和温度越高毒性越大 不同种类渗性保护剂毒性的差别 种类 已二醇 甘油 二甲亚砜 丙二醇 已酰胺 胚胎发育能力％ 98 88 68 16 0 第九页，共48页。 5. 寒冷对细胞的损伤 37℃—0℃ 寒冷损伤, 20℃～ 0℃ 细胞膜双层脂质结构，含水30％～50％ ,其余为脂蛋白，对寒冷敏感，低温脂类变硬，脂蛋白分解，变性 脂质的含量和成分影响细胞对冷冻的耐受性 脂质含量丰富的牛、猪卵母细胞易受寒冷的损伤， 卵磷脂/胆固醇比值大，柔韧性好，耐受冷冻 第十页，共48页。 二、预防冷冻损伤的方法 冷冻保护剂——渗性，非渗性，大分子 控制冷冻和复苏的速率－细胞种类，温度 快速去除冷冻保护剂 第十一页，共48页。 （一）冷冻保护剂的种类和作用 1. 渗性 2. 非渗性 3. 大分子 第十二页，共48页。 1. 渗性保护剂的作用 无限降低冰点 （1000g水＋1mol溶质 冰点降低1.86℃，浓度足够高冰点～共熔点玻璃化而不结冰） 与水形成氢键，维持结合水 替换细胞内液态水，细胞失水后体积和溶质浓度变化小 第十三页，共48页。 渗性保护剂的渗透性 种类 已二醇 丙二醇 二甲亚枫 甘油 分子量g/mol 62.07 76.1 78.13 92.09 已二醇分子量小，渗透性好，进出细胞快，毒性低用于玻璃化冷冻 第十四页，共48页。 2. 非渗性保护剂的作用 不能进入细胞内（蔗糖，葡萄糖，果糖，海藻糖） 冷冻时有助于细胞脱水 复苏时防止水分过快进入细胞，预防渗性休克，促进渗性保护剂外流 降低细胞膜损伤 第十五页，共48页。 3. 大分子物质 促进玻璃化形成 增加细胞膜的稳定性 减少渗性保护剂毒性， Ficoll，P