PCR突变技术方法概览[收集].pdf

易错 PCR 构建 AKP 突变体实验参考资料 PCR突变技术方法概览 1 基于 PCR的体外诱变技术 定点突变的方法很多，而基于 PCR 的定点突变技术由于其突变效率高，操作简单，耗 时短， 成本低廉等优点而倍受瞩目。 近十年来，基于 PCR 的定点突变技术获得了长足的发 展，目前运用此技术已能实现各种类型的基因突变。 基因突变实验包括以下几个步骤 :1 目的基因全序列变异文库的构建 ;2 利用高通量表达 筛选载体从变异文库中筛选表达突变体 ;3 表达突变体的鉴定和表达研究。 1.1 重叠延伸 PCR（over-lap extension PCR OE-PCR ） 这种方法运用非常广泛、灵活，不受突变位置及突变类型的限制，利用 OE-PCR 不仅能实 现基因点突变，还能便利地实现大片段的插入及删除及插入。 其基本原理如图 （1）所示。 首先设计两个 PCR 反应以产生两个含突变位点的 DNA 片段， 随后将上述两个 PCR 产物混合， 二者通过末端互补区结合并在适宜的温度下互引物延伸得 到完整的含突变的基因，对第一次 PCR 产物进行纯化处理可显著提高突变效率。 OE-PCR 不足之处在于： ○1 一个突变需要两对引物， 3 次 PCR，并且需对中间产物进行纯 化。相对而言步骤较烦琐，不经济； ○2 由于 DNA 二级结构及互补链的竞争等因素的影 响，有时两个中间产物难于有效地相互结合导致目的产物得率很低；○ 3 当利用 Taq 聚合 酶进行 PCR 反应时，经常在 PCR 产物末端加上腺苷酸，这一多余的腺苷酸一方面导致两 个中间产物难于有效地相互结合，另一方面可能会插入基因中导致产生非预期的移码突变。 针对这些不足，后来许多学者对 OE-PCR 进行了改进。 1997 年， Urben 等提出一步重叠延 伸 PCR 法（ one-step overlap extension PCR ），使得三个 PCR 反应得以在一个试管里进行， 并且省略了烦琐的中间产物纯化过程。其原理是首先将待突变的 DNA 以相反的方向克隆 到两个载体中， 这两个载体除了多克隆位点相反外其余均相同 （例如 pUC18,19 ）。这样便得 到两个模板。 将这两个模板， 两个突变引物及一个与载体互补的通用引物置于一个试管中进 行一次 PCR 反应即可得到含突变的目的基因。 1997 年， Warrens 等利用不对称 PCR 反应 产生单链中间产物，消除了互补链的竞争性影响，显著提高了目的产物的得率。 1990 年,Horton 等用 T4DNA 聚合酶处理中间产物，降低了移码突变的发生率。由于 OE-PCR 几 乎没有任何特殊条件的限制，而且成功率很高，因此运用非常广泛。 第 1 页 共 8 页 易错 PCR 构建 AKP 突变体实验参考资料 1.2 大引物 PCR 法(megaprimer PCR) OE-PCR 虽然突变成功率很高，但一次突变需要两对引物，进行三个 PCR 反应，还 需对中间产物进行纯化。 因此，相对而言成本偏高， 操作较烦琐。 大引物 PCR 法是 OE-PCR 的改进版，利用大引物 PCR 法只需三个引物，两个 PCR 反应，而且无需中间产物纯化等 步骤。