PCR引物的优化设计[参考].pdfVIP

PCR引物的优化设计 PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的寡核昔酸片段， 其中在扩增的 DNA 片断 5’端的 引物对应于有意链 DNA 序列， 3’端的引物对应于无意链 DNA 序列，使其能有效地扩增模 板 DNA 序列。因此，引物的优劣直接关系到 PCR的特异性与成功与否。 要设计引物首先要 找到 DNA 序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。若这个区域 单链能形成二级结构， 就要避开它。 如这一段不能形成二级结构， 那就可以在这一区域设计 引物。 根据实验需要，确定需要扩增的 DNA 序列，并知道其 CDS区序列（编码结构基因区 ,即从起 始密码子区至终止密码子区 1. 根据实验需要， 确定需要扩增的 DNA 序列， 并知道其 CDS区序列 （编码结构基因区 ,即从 起始密码子区至终止密码子区） ncbi 网站查询 2. 选择所需的载体 ,确定合适的酶切位点。 所选择的酶切位点尽量为多克隆位点的中间酶切位点，且载体上其它地方无该酶切位点。 这样连接以后再构建新的质粒时选择酶的空间更大些。并保证所需扩增的 DNA 序列中无该 酶切位点（ generunr 分析）。 4. 正向引物的设计 4.1 酶切位点的位置选择。一般情况下都需要在引物的 5’，3 ’端增加酶切位点，然后利用 该酶将扩增产物切下，接到相应的载体上。 A ：扩增的 DNA 用于表达时： (1) 自身有启动子。 如果要利用自身的启动子， 扩增片段里应包含启动子， 所以酶切位点应该在启动子前面。 可 在所扩增的 DNA 序列的启动子前寻找是否有该酶切位点，若有则直接利用该酶切位点进行 扩增；若无可寻找与其基本相似的位点进行扩增。 (2) 扩增片段里自身无启动子。 对于自身无启动子而又用于表达的基因序列， 必须将其接于外源启动子的后面才能顺利表达。 在翻译过程中， mRNA 必须首先与核糖体相结合才能进行蛋白质合成。 在原核生物中， mRNA 分子上有两个核糖体结合位点，一个是起始密码子 AUG，另外一个是起始密码子 AUG 上游 3bp-11bp 处的 3bp-9bp 的序列，后者由 Shine J 及 Dalgarno L 发现，故称为 SD 序列。 SD 序 列富含嘌呤核苷酸，而 16S rRNA3’端富含嘧啶核苷酸，二者刚好互补，可促进 mRNA 核糖 体结合，提高翻译效率。因此，在基因重组过程中应将结构基因接于 SD 序列之后，以便为 mRNA 提供核糖体结合位点，提高基因表达效率。起始密码子与 SD序列之间核苷酸数量变 化过大会影响翻译效率，所以应该将目的基因的起始密码子与启动子的 ATG 相重叠，这样 才能保证起始密码子与 SD 序列之间核苷酸数量不改变，不影响翻译效率。 一般的启动子 3 ’断酶切位点是 NcoI（CCATGG）或 Nde I(CATATG)，若添加的酶切位点为 NdeI ， 引物的 5 ’端酶切位点设计为 Nde I 即可；若添加的酶切位点为 NcoI 时 ,应该根据目的基因起 始密码子后的碱基种类的不同选择不同的酶切位点：如果该碱基是 G，则可以直接设计为 NcoI 位点； 如果该碱基不是 G （如扩增的目的基因为 5 ’-aagtcgtatg actaccgttc ccgatctcga-