糖酵解中间产物的鉴定试验操作步骤.docx

糖酵解中间产物的鉴定实验操作步骤 一、 实验目的 了解糖酵解过程的某一中间步骤及利用抑制剂来研究中间代谢的方法。 二、 实验原理 利用碘乙酸对糖酵解过程中 3- 磷酸苷油醛脱氢酶的抑制作用，使 3- 磷酸苷油醛 不再向前 变化而积累。硫酸肼作为稳定剂，用来保护 3- 磷酸苷油醛是不自发分 解。然后用 2， 4- 二硝基苯肼与 3- 磷酸苷油醛在碱性条件下形成 2， 4- 二硝基苯 肼 - 丙糖的 棕色复合物，其棕色程度与 2- 磷酸苷油醛含量成正比。 三、 仪器原料和试剂 (1) 仪器：试管 (1.5 x 1.5cm )、吸量管 (1ml、、 2ml3ml )、恒温水浴、烧杯 (50ml )。 (2) 原料：新鲜酵母。 (3) 试剂 : ① 2， 4- 二硝基苯肼： 0.1g2， 4- 二硝基苯肼溶于水 100ml 2mol/L 盐酸溶液中， 贮于棕色 瓶中备用。 ② 0.56mol/L 入 NaOHS pH 硫酸肼溶液：称取 7.28g 硫酸肼溶于 50ml 水中，这时不会全部溶 解，当加 达 7.4 时则完全溶解。此液也可用于水合肼溶液配制， 可 按其分子浓度稀释 至 0.56mol/L ，此时溶液呈碱性，可用浓硫酸调 pH 至 7.4 即 可。 ③ 5%葡萄糖溶液。 ④ 10 应氯乙酸溶液。 ⑤ 0.75mol/LNaOH 溶液。 ⑥ 0.002mol/L 碘乙酸溶液。 四、操作步骤 (1)取小烧杯 3 只，分别加入新鲜酵母 杯 5%葡萄糖加入 号 量/ml 1 10 2 10 3 10 10%E 氯醋酸加 入量 /ml 2 -- -- (2)将各杯混合物分别倒入编号相同的 0.3g ，并按下表分别加入各试剂，混匀 碘乙酸加入量 /ml 1 1 -- 发酵罐内，放入 硫酸肼加入量 /ml 1 1 -- 发酵时起泡多 少 37 E 保温 1.5h ，观察发 酵管产生气泡的量有何不同。 (3)把发酵管中发酵液倾倒入同号小烧杯中并在 2 号和 3 号杯中按下表补加各 试剂，摇匀 放 10min 后和第一只烧杯中内容物一起分别过滤，取滤液进行测定。 杯号 10%E 氯乙酸 /ml 碘乙酸 /ml 硫酸肼/ml 2 2 -- -- 3 2 1 1 (4)取 3 个试管，分别加入上述滤液 0.5ml ，并按下表加入试剂和处理 1