分解尿素、纤维素的分离、计数知识小结.docx

PAGE / NUMPAGES 课题2 土壤中分解尿素的细菌的别离 一、筛选菌株 1.原理：人为提供有利于目的菌生长的条件 ,同时抑制或阻止其他微生物的生长 2.例子： DNA多聚酶链式反响〔PCR〕：一种在体外将少量DNA大量复制的技术。 此过程需耐高温的DNA聚合酶 从水生耐热细菌Taq中别离耐高温的TaqDNA聚合酶 3.筛选尿素分解菌的培养基成分 尿素作为惟一的氮源(选择培养基、固体培养基) 二、菌落计数 1.方法：稀释涂布平板法 不同的微生物选用的稀释度不同 ,如细菌：104、105、106；放线菌：103、104、105；真菌：102、103、104. 2.设置对照：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响 ,提高实验结果的可信度 〔1〕证实培养基是否被杂菌污染 空白对照：将不接种的培养基置于相同温度恒温箱培养 ,如无菌落生长 ,那么未污染 〔2〕证明选择培养基是否有选择作用 用普通培养基〔或牛肉膏蛋白胨培养基〕进行接种培养 ,假设选择培养基中菌落种类数明显少于普通培养基 ,那么起到选择作用。 3.统计菌落数目的方法： (1)显微镜直接计数法 ①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板 ,在显微镜下计算一定容积样品中微生物数量 ②方法：用计数板计数。 ③缺点：不能区分死菌与活菌。 (2)活菌计数法 ①原理：当样品的稀释度足够高时 ,培养基外表生长的一个菌落 ,来源于样品稀释液中的一个活菌。 ②活菌数的计算方法：每克样品中的菌株数＝ (平均菌落数÷涂布的稀释液体积)×稀释倍数。 ③统计的菌落数比实际数目低 因为当两个或多个细胞连在一起时 ,平板上观察到的只是一个菌落 ,因此统计结果一般用菌落数表示。 4.操作： 〔1〕设置重复组〔每一稀释度的菌液涂布3个或3个以上的平板〕 ,增强实验的说服力与准确性。 〔2〕计数的时机：各平板上菌落数目稳定〔防止因培养时间缺乏而导致遗漏菌落的数目〕 〔3〕选择可用于计数的平板 ,一般选择菌落数在30～300的平板进行计数并求平均值。 ①如果得到了2个或2个以上菌落数目符合要求的平板 ,那么说明稀释操作比拟成功； ②如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大 ,说明试验不精确 ,需要重新实验； 5.菌落 〔1〕一个菌落是一个种群 〔2〕菌落的特征：形状、大小、隆起程度和颜色等。 四、检测 1.方法：检测培养基pH的变化判断 2.试剂：酚红指示剂 3.原理：在细菌分解尿素时 ,分泌的脲酶将尿素分解为氨 ,氨使培养基碱性增高 ,pH升高 ,指示剂将变红。 课题3 分解纤维素的微生物的别离 1.纤维素酶 ①组成：一种复合酶 ,它至少包括三种组分 ,即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶。 ②作用 eq \x(纤维素)eq \o(――→,\s\up7(C1酶、Cx酶))eq \x(纤维二糖)eq \o(――→,\s\up7(葡萄糖苷酶))eq \x(葡萄糖) 2.纤维素分解菌的筛选 (1)方法：刚果红染色法。常用的有两种方法 ,一种是先培养微生物 ,再参加刚果红进行颜色反响；另一种是在倒平板时就参加刚果红。 (2)原理：刚果红＋纤维素→红色复合物eq \o(――→,\s\up7(纤维素酶))纤维素被分解 ,出现以纤维素分解菌为中心的透明圈 ,我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。 3.实验流程 eq \x(土壤取样)：选择富含纤维素的环境 选择培养?可省略?：目的是通过选择培养增加纤维素分解菌的浓度 eq \x(梯度稀释) eq \x(涂布培养)：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上 eq \x(筛选菌株)：刚果红染色法 ,挑选产生透明圈的菌落 eq \x(纯化培养) 4.课题延伸 (1)为了确定别离得到的是纤维素分解菌 ,还需要进行发酵产纤维素酶的实验 ,纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。 (2)纤维素酶的测定方法：一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖含量进行定量测定。