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His标签融合蛋白纯化步骤 His标签融合蛋白纯化步骤 His 标签融合蛋白纯化步骤 （Ni-NTA 琼脂糖凝胶亲和层析纯化法） 1. 缓冲液配制 ◆ L ysis Buffer 1 (under native condition) 0.5mM Tris.HCl 0.5M NaCl 5%(w/v) glycerol 10mM Imidazol 100mg(1mg/ml)lysozyme (Purification of 6xHis-tagged proteins from E.coli ) 1% Nonidet P40 (NP40 = Igepal CA-630 ) 0.25% Tween 20 （or Triton 100） 0.02% NaN3 (Optional) 2 tablets of protease inhibitor cocktail (EDTA free， Recommended) 200 μg(2μg/ml) RNase A (Optional) 1mg (10μg/ml) DNase1 (Optional) 50 mM NaF (Optional) 1mM Na3VO 4 (Optional) + ddH2O to 100ml, Adjust pH to 8.0 using NaOH 此 lysis buffer 适用于从 E.coli 、哺乳动物细胞和昆虫细胞中纯化带His 标签的蛋白质。仅在用于裂解 E.coli 细菌时，加入溶菌酶。 Na3VO4是磷酸酶抑制剂，保护磷酸化的蛋白不被磷酸酶还原。NaF 是酯酶抑制剂，保护脂蛋白不被酯酶降解。 注意：当使用镍琼脂糖凝胶纯化带His 标签的蛋白时，缓冲液中不能加EDTA ，因EDTA 能使镍从螯合物上脱离，从而使分离介质失去效果。 ◆ L ysis Buffer 2(under denature condition) 50 mM Tris-Cl 8 M Urea (or 6 M Gu-HCl) 10mM Imidazole 0.05% Tween 20 Adjust pH to 8.0 using NaOH ◆ D ialysis/Tev cleavage Buffer 50 mM Tris-Cl,pH8.0 100 mM NaCl (depends on solubility of protein) 2.5% glycerol 0.5mM EDTA 0.5mM DTT or TCEP ◆ 缓冲液A ： 50mM Tris.HCl 0.5M NaCl 5% glycerol 0.05% Tween 20 用高浓度HCl 调节pH 值至8.0。 ◆ 缓冲液B （洗脱缓冲液）： 50mM Tris-Cl 0.5M NaCl 5% glycerol 0.05% Tween 20 500mM 咪唑 用高浓度HCl 调节pH 值至8.0。 ◆ 缓冲液C （咪唑梯度洗脱液）：用缓冲液A 和缓冲液B 按不同比例配制，配制比例如下（100ml 2. 样品预处理： 按每克湿重菌体/4~5ml Lysis Buffer 的比例充分悬浮离心收集的菌体，置-80oC 冰箱过夜；在4oC 融解菌体，vortex 悬浮细菌， 400w 功率下，每个循环超声5s ，冷却5s ，每次10 min，共循环2次破碎菌体；4℃、12000rpm 离心30min ，收集上清液或者用0.45μm 滤膜过滤，并用低浓度NaOH 调节 pH 至8.0待纯化。 3. 操作步骤 ◆ 介质平衡与亲和 取 1ml Ni-NTA琼脂糖凝胶（金益肽TM NTA 货号：JYT-M0007），置入15ml 离心管中，2000 rpm离心2 min，移去上清液；加入5ml Lysis Buffer，混匀，低速离心，去上清。加入4-5 ml细胞（细菌）裂解液，置于混匀转盘，4oC 低速旋转1小时。 (每个品牌的NI 柱载量都不同，金益肽TM NI-NTA琼脂糖凝胶载量40mg/ml，请根据目标蛋白的浓度、分子量大小、及体积来选取适量的Ni-NTA 琼脂糖凝胶) ◆ 装柱 1) 将层析柱固定在铁架台或层析架上，封闭层析柱下端出口，向柱内充入纯水，排开层析 柱内空气，先将垫片完全浸没于水面下方，在保持水平的状态下，小心推向底部，避免垫片下方滞留气泡。 2) 打开层析柱下端出口，排出柱中纯水；在液面低至距垫片1~