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中国海洋大学 硕士学位论文 褐藻胶酶解寡糖的制备、分离和结构鉴定 姓名：张真庆 申请学位级别：硕士 专业：生药学 指导教师：管华诗 2003.6.1 酶解褐藻胶寡糖的制备、分离和结构鉴定 目的：本论文利用菌株勿从i。510产生的褐藻胶裂解醒降解褐藻胶，探讨酶 解得到褐藻胶寡糖的生产工艺，及分离纯化褐藻胶寡糖以得到相应标准品从而丰 富海洋寡糖库，以此为基本目的和出发点，并且为探讨该褐藻胶裂解酶酶解行为、 酶解位点，做先期的工作。方法；应用紫外法与DNS法对该褐藻胶裂合酶的酶 活进行测定。应用紫外扫描法、凝胶渗透色谱技术(HPGPC——TSK G2500PWxl) 和聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)对不同时间酶解产物组分的分子量及相对含 量加以分析。对酶解寡糖进行分离纯化:应用凝胶过滤色谱法(Bio-Gel P-4; P-6)、 快速液相色阴离子交换色谱法(Q-Sepharose. Fast Flow),其间应用新技术 快速液相色 谱仪(FPLC)对分离条件进行优化和确定。对所得寡糖应用灌注色谱技术 (HQ-20)检测其纯度，并应用此方法进一步纯化；同时运用荧光辅助糖电泳 (FACE)和高效毛细管电泳(HPCE)技术作为进一步检测纯度的方法。应用 ESI-MS、NMR等对得到的寡糖进行结构鉴定。结果：本文应用紫外法和DNS 法对该酶的酶活进行检测，从海藻中筛选出的菌株为6再。510所产褐藻胶裂解酶 有较高的比活力：22.5unit/mL。HPGPC和PAGE方法对褐藻胶的降解程度有良 好的检测效果，快捷、高分辨率和直观是这两种方法的共同点。凝胶渗透色谱与 阴离子交换色谱均对褐藻胶寡糖有良好的分离效果，得到四个组分。经灌注层析 进一步纯化，应用FACE和HPCE检测二糖为一结构单的化合物，三糖到五糖 均有异构体的存在。应用ESI-MS确证四个组分分别为二糖到五糖，且聚合度单 一。同时对结构单一的二糖利用】H-NMR, -C-CMR,比丁七HNjQC和「中官 COSY进行了结构昼磐——非还原端存在双键的古罗糖醛酸二壁。讨论：一方 面，通过进一步的分离纯化得到单一结构的化合物「五对单体结构进行分析确定 的同时，所得结果将会为酶解行为特点的确定提供必要的信息，以便于对酶解工 艺作进一步的指导；另一方面得到较高聚合度的寡糖，并进行活性的筛选。 关键词：褐藻胶裂解酶寡糖分离纯化结构分析 Preparation, Isolation and Structure elucidation of alginate oligomers degraded by the alginate lyase Abstract This thesis mainly involved the producing technics and preparation of alginate oligomers degraded by an alginate lyase, which was produced by a stain Vibrio 510 selected from algae, as markers. Another aim of preparation is enrichment of library of marine oligosaccharides. At the same time isolation purification and structure confirming of these blocks is the first stage of determination of action pattern of the lyase. The alginate lyase has higher specific activity of 22.5unit/mL. Analysis of the degree of degradation by UV scan, HPGPC and PAGE, analysis of samples molecular and percent of every fraction by HPGPC, in which series TSK G3000PWXl and TSK G2500PWxl was applied, are the foundation of producing technics of alginate oligomers. Isolation and purification of alginate oligomers: Gel filter chromatography (Bio-Gel P*4, P-6) and anion exchange chromatography(Q- sephar