荧光定量PCR技术检测黑素瘤BRAF基因突变.ppt

荧光定量PCR技术检测黑素瘤BRAF基因突变 目录 黑色素瘤概况 BRAF基因与黑色素瘤 实时荧光定量PCR检测BRAF突变 BRAF基因检测对于黑色素瘤的意义 黑色素瘤概况 恶性黑色素瘤(黑色素瘤)是临床上较为常见的皮肤粘膜和色素膜恶性肿瘤，也是发病率增长最快的恶性肿瘤之一，年增长率为3％～5％。2010年全球黑色素瘤新发病例199 627例，死亡例数为46372例［1］。 虽然黑色素瘤在我国发病率较低，但近年来成倍增长，每年新发病例约2万例［1］。 ［1］CSCO黑色素瘤专家委员会，中国黑色素瘤诊治指南(201 1版)，临床肿瘤杂志2012年2月第17卷第2期 BRAF基因与黑色素瘤 检测我国468例原发黑色素瘤标本，BRAF突变率为25,9％其中BRAFV600E是最常见的突变位点(87％)，这为中国患者使用BRAFV600E抑制剂(Vemurafenib)提供了理论基础［1］。 在103个治疗中心共入组了675例不能手术切除的Ⅲ期或Ⅳ期的初治黑色素瘤患者，结果Vemurafenib组的客观有效率达到48％而达卡巴嗪(DTIC)组仅5.5％，故在指南中也将Vemurafenib作为BRAFV600E 突变患者的一类证据推荐。 ［1］CSCO黑色素瘤专家委员会，中国黑色素瘤诊治指南(201 1版) 临床肿瘤杂志2012年2月第17卷第2期 丝裂原活化蛋白激酶( MAPK) 信号转导通路 该通路在细胞的生长、分化和增殖中起着重要作用，通路通过 Ｒas、Ｒaf、有丝分裂原活化蛋白激酶( MEK)及胞外信号调节激酶( EＲK) 的特异性级联磷酸化将信号由细胞外传入细胞核内［2］。 ［2］董高超，周 湘，唐伟方，陆 涛.B-Ｒaf 激酶抑制剂的研究进展［J］ 中国药科大学学报2014，45( 1) : 1 － 9. BRAF基因 RAF激酶家族有3个亚型: ARAF、BRAF和CRAF。这 3 个亚型均有 3 个保守区域 CR)：CR1、CR2 和 CR3。 研究表明BRAFV600E的催化活性比野生型 B-Ｒaf 活性高 500 倍［3］ ［3］Wan PTC，Garnett MJ，Ｒoe SM，et al． Mechanism of activation of the ＲAF-EＲK signaling pathway by oncogenic mutations of B-ＲAF［J］． Cell，2004，116( 6) : 855 － 867. ARMS引物只和突变位点结合，然后Taq DNA多聚酶启动PCR反应 ARMS引物不与野生型靶DNA结合，因而Taq DNA多聚酶无法启动PCR反应 扩增阻碍突变系统PCR原理 引物与探针结合区的上游序列结合 引物延伸复制的区域与探针区互补 阻止 基团使DNA多聚酶不能复制探针区 随着温度升高，引物延伸序列变性 温度降低，引物延伸序列内部杂交荧光基 团远离淬灭基团开始有荧光信号未延伸 引物则退火，荧光信号被淬灭 实时荧光定量PCR检测BRAF突变步骤 第一步：石蜡组织切片DNA提取 第二步：样品评估 第三步：样品检测 石蜡组织中DNA提取 1.石蜡组织切片收集及鉴定 2.组织切片刮取 3.加热裂解消化DNA 4.去除石蜡 5.吸附柱收集DNA 实时荧光定量PCR质量监控 1、样本DNA评估 体系: 加入5μl样本，BRAF positive control以及无酶水（NTC） DNA样品质量结果分析 1) NTC在FAM通道的Ct值小于40表示有污染； 2) BRAF positive control (PC)在FAM通道的Ct值必须在27.82-33.85之间，如果不在这个范围，说明设置有误； 3) 在BRAF positive control和NTC都满足要求的情况下，样本FAM通道Ct值必须在20.95-33.00之间； 4) 样本FAM通道Ct值小于20.95，即使是非常接近20.95，样本必须稀释至Ct值在20.95-33.00之间，可以按照每稀释两倍Ct值增加1计算； 检测BRAF突变 体系： 加入待测5μl样本，BRAF positive control 以及无酶水（NTC） NTC在FAM通道的Ct值小于40表示有污染BRAF positive control (PC)在FM通道的Ct值必须在27.82-33.85之间 A 样本分析 mutation Ct – control Ct = ΔCt 检测的意义 对病理确诊黑色素瘤的患者进行BRAF突变检测对于指导临床用药十分必要。实时荧光定量PCR法（TaqMan）是