优秀医学课件8临床基因扩增检测项目室间质评介绍201707 - 发送.pptx

临床基因扩增检测质量评价及 问题分析;定性测定;定量测定;30次循环后靶序列扩增的数量;基线：PCR反应起始阶段，扩增产物很少，产生的荧光信号很低。基线荧光信 号可根据此阶段产生的荧光信号来计算。 阈值：基线信号的10倍标准差。 Ct：扩增过程中荧光信号强度超过阈值的循环数。;线性基线期 指数期初期 指数期 平台期;基线的设置;阈值的设置;有内标的实时荧光PCR测定的抑制物存在 的判断;ARMS法基本原理;假阳性结果——交叉反应;基本计算公式的推导;纵坐标为Ct值横坐标为起始拷贝 数时的数学模型;纵坐标为Ct值横坐标为起始拷贝 数时的数学模型;纵坐标为Ct值横坐标为起始拷 贝数时的数学模型;拷贝数/ml IU /ml ?;SI单位;举例;;组成 PCR仪 荧光检测系统 计算机及软件系统;PCR反应;;ABI7500;LC480;荧光染料的激发和发射波长;通道：单通道 可用染料：FAM，SYBR Green I 激发光波长：450-495nm 发射光波长：515-545nm 灵敏度：检测5nM的荧光素 检测范围：100 —108拷贝 容量：96样品 均一性： ±0.4 ℃ 升降温速率：最高3 ℃/s 温度梯度：有;实时荧光PCR仪参数举例2;;ABI7500和LC480参数比较;仪器维护 参照厂家说明书； 建立本实验室的维护SOP和记录;ABI 7500维护SOP举例;仪器维护/校准SOP的问题;维护的主要方面;ABI 7500维护SOP举例;ABI 7500维护SOP举例;;病原体检测;核酸检测（病毒学）;; HBV DNA （定量）;各实验室检测结果;;总体结果和3种试剂检测均值与靶值的相关 性曲线;不合格参评实验室结果分析-例;肿瘤靶向治疗相关基因突变检测;非小细胞肺癌主要靶向药物作用位点;;治疗方案的选择;肿瘤靶向治疗相关分子检测;EGFR、KRAS、BRAF参评实验室情况;;煮沸法 磁珠法 柱提法;煮沸法 磁珠法 柱提法;PCR-直接测序——KRAS;Sanger测序是目前认为此类检测的“金标准 ”，但是在质评中，结果比较混乱。 以2015年PIK3CA突变检测为例： 5家Sanger测序实验室均出现假阳性结果， 即在预期突变类型的基础上，又报告了其它 类型的突变。;样本号;金标准？ PCR产物“污染”？ 单个实验室出现的E542K假阳性结果 测序为外送检测？ 实验人员对测序结果的分析？;样本编号;;结果报告 与解释;可检测的突变范围 检测性能??敏感性）;EGFR基因;方法学名称;由于实验室的情况和预期用途不同，在质 评中，对实验室必须检测该基因的哪些突 变没有规定； 但要求实验室选择检测范围，实验室检测 范围的结果必须正确。;检测范围;肿瘤体细胞突变高通量测序检测;Cheng L, et al. Molecular pathology of lung cancer: key to personalized medicine. Mod Pathol. 2012;25(3):347-69.;Presented By Ignacio Wistuba at 2016 ASCO Annual Meeting;肿瘤体细胞突变高通量测序检测流程;Kotelnikova EA, et al. Oncotarget. 2016;MAY.;目前面临的挑战;NGS试剂的审批;临床有效性;临床意义明确的突变/无明确临床意义的突变;同癌异治，异癌同治 审批时验证的预期用途和使用范围，是否 可扩展？;;不同panel的 实验室数 （按基因数分 类）;错误原因1;错误原因1;错误原因1;错误原因2; Gene;错误原因3;是否对标签识别能力进行性能评价？识别错误率？;假阴性结果 对基因突变的漏检， 特别是部分实验室对如 KRAS:c. 34GC(p.Gly12Arg) （频率10%） 、NRAS:c.35GA(p.Gly12Asp)（频率20%） 、 PIK3CA:c.1624GA(p.Glu542Lys) （ 频 率 10%）等具有明确临床意义的突变漏检，是非常 严重的错误。;部分实验室在报告中注明其检测范围是所列 出基因的全部突变，但实际上，实验室并不 具有这种能力。实验室应当在对检测体系进 行性能评价时明确自己的真正检测范围。 实验室是否了解其检测范围？;错误原因4;科研;为什么要参加室间质量评价？;室间质评是临床实验室对结果进行外部比 对的平台，是实验室通过此平台，监测本 实验室检测质量的过程。 EQA对实验室的质量改进作用：出现检测 结果不符问题－寻找原因并评估对日常标 本的检测错误风险－采取措施进行改进（ 仪器设备、试剂、人员操作流程等）;