荧光定量PCR技术讲座：理论基础、引物及探针设计、体系优化、实验方案、数据分析、污染防控.ppt

七、实验中污染的防控 2、荧光定量PCR实验中污染的防控 （4）、对于未知污染源的顽固的污染的防控 这类污染也经常出现，找不到明确的污染源，而且此类污染又非常 顽固，对于这种情况，最好的办法就是不去管它，在采用绝对定量 和双标准曲线法时，污染的初始模板量可由阴性对照检测出来，知 道了污染的初始模板量后，我们可以把测得样品的初始模板量减去 污染的初始模板量，在分析时就避免了污染造成的误差。 七、实验中污染的防控 图中最后一个样品为阴性对照，本来应该是一直线，但是仪器也检测到了荧光信号 七、实验中污染的防控 电泳结果显示，该阴性对照确实有PCR产物出现 七、实验中污染的防控 通过定量PCR检测，测得该阴性样品中含有227个初始模板。假如这个污染属于是顽 固的未知污染，可以用正常样品测得的初始模板量减去227，来避免污染引起的误差 八、实验结果的分析 实验结束后将得到的结果进行分析，现在很多软件都带有结果的自动分 析功能，可以将结果直接转化为各种图表及柱状图。对于和实验预期偏离 比较大的样品，需重复实验。 一、荧光定量PCR技术的基础理论 6、双链核酸的熔解曲线分析 对于核酸序列相同的PCR产物，其TM值也相同，而且其TM值在一个很小 的温度范围内，在此温度区间，其序列相同的核酸双链全部打开，荧光强 度急剧降低，以荧光强度的变化率和温度来作图，则可得到如下图： 一、荧光定量PCR技术的基础理论 6、双链核酸的熔解曲线分析 上图就是熔解曲线，熔解曲线反映的是一定序列长度的核 酸双链，在一定的离子强度下的TM值。核酸双链的TM值由双链 核苷酸之间相连接的氢键决定，不同的核酸双链，其TM值也不 同，所以通过熔解曲线，我们能获知双链核酸的均一性、野生 型和突变型双链之间的碱基差异等，如果采用高分辨率荧光染 料，链条核酸双链哪怕只有一个碱基的差异，通过熔解曲线也 能分析出来。 电泳是通过核酸分子量的大小和构象来分析的，熔解曲线 是根据双链核酸的TM值来分析的，这与琼脂糖电泳及SSCP有异 曲同工之处。 一、荧光定量PCR技术的基础理论 7、绝对定量和相对定量 一、荧光定量PCR技术的基础理论 7、mRNA差异表达的相对定量分析 研究基因表达的情况，我们只需搞清楚该基因在不同生理阶段的变化 趋势如何就行了，而无需知道该基因的绝对量有多少。 实验操作中，由于样品选取时样品的细胞个数不可能完全相同，RNA提取 时得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初 始样品浓度不同，这就造成了比较上的混乱，因此在进行基因表达调控研 究中都会用一些看内参基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成 的差异。常用的内参基因是在各种生理条件下表达量恒定的基因，这些基 因也常被称为看家基因，该基因表达一般不随外界的变化而变化，所以常 被用作内参照，常用的内参基因有GAPDH基因、β-Actin基因，18srRNA基 因等。 一、荧光定量PCR技术的基础理论 7、mRNA差异表达的相对定量分析 以上公式就是引入内参基因后相对定量分析的基本公式，并由此派生出两种相对定量的分析方法：双标准曲线法和Delta-delta Ct法。 一、荧光定量PCR技术的基础理论 7、mRNA差异表达的相对定量分析 （1）、双标准曲线法 所谓的双标准曲线法就是对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对定量，求出每个样品中内参基因和目的基因的绝对数量，然后根据相对定量的基本公式来求出目的基因的差异表达。 双标准曲线法的特点： （a）、考虑到了不同基因扩增效率的差异，用标准曲线来校正扩增效 率，最大限度的避免了误差； （b）、思路直观、条理清晰、应用简便，操作灵活，无需像Delta- delta CT法那样对实验进行反复的优化； （c）、其不足之处是每次实验都必需对目的基因和看家基因做标准曲 线； （d）、该方法适合样品量大，但是所分析目的基因较少的实验。 一、荧光定量PCR技术的基础理论 7、mRNA差异表达的相对定量分析 （2）、2 -△△CT法 该方法的前提条件是目的基因和内参基因的扩增效率相同且都为1，在试验开始前必须分别对目的基因和内参基因作标准曲线，看两者扩增效率的差别，假如两者扩增效率之间的差异小于0.1，就可以用该方法分析。而且在接下来的实验中，无需再做标准品。 该方法要求严格的重复，因为CT值的差异只要有很小的变化，测得的结果就会有很大的差别。 该方法特别适合于样品量不大，但是检