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何选择适合的色谱柱 何选择适合的色谱柱 何选择适合的色谱柱 选择色谱柱时需要首先考虑的是分离规模 1、根据分离规模确定色谱柱大致的规格 表1 按分离规模分类的高效液相色谱柱 微型柱 毛细管柱 纳米柱 柱径/mm 10 5～10 2～5 0.8～2.0 0.05～0.5 2、从分析物的物理化学性质入手，找出大致的色谱柱类型 选柱前应详细掌握分析物的分子量（或分子量范围）、溶解性、是否解离等信息，然后根据这些性质找到合适的色谱柱类型。 表2 液相色谱分离模式的选择 量 溶解性 分离模式 色谱柱 备注 溶于正己正相吸附色 呋喃 GPC Silica 2000 正相键合色氰基柱、氨基柱 谱 溶于甲醇/水 C18、C8、PH 或PLRP(反填料孔径通 反相色谱 常为100? 相聚合物色谱柱) 非离子型 反相色谱 C18、C8、PH 或PLRP 水溶性 离子抑制色C18、C8、PH 或PLRP 谱 离子型 离子对色谱 C18、C8、PH 或PLRP 离子交换色AX 、CX 脂溶性 GPC GFC 反相色谱 C18、C8、C4或PLRP 填料孔径通 反相色谱 C18、C8、C4或PLRP 常为300? 离子交换 AX 、CX 大于蛋白2000 水溶性 多肽、质 离子型 对于色谱柱类型的选择有一些特殊说明： 1. 反相柱是使用最广泛的色谱柱，而ODS 又是反相柱中使用最广泛的，据统计目前使用的色谱柱中超过一半是ODS 柱；由于ODS 柱的技术最成熟，所以具有高性能、长寿命等特点，所以选择时优先选择ODS 柱； 2. 对于反相柱，通常来讲，碳链越长，对化合物的保留越强，分离效果也越好，但选择短碳链的键合相可以节约分析时 间； 3. 反相色谱柱可以对非极性、弱极性、中等极性以及部分强极性化合物进行分离，是应用最广的色谱柱；反相色谱柱以“分配作用”保留分析物，主要以分析物在两相中的溶解性进行选择，有时不能对同分异构体和结构类似物进行分离； 4. 部分解离性较弱的化合物，可通过向流动相加入酸、碱、盐的形式使分子以某种稳定并且保留性强的形式存在，然后用反相柱进行分析，这种分析方法包括“离子抑制色谱”和“离子对色谱”； 5.PLRP是以聚苯乙烯-二乙烯基苯为填料的色谱柱，为反相柱，疏水性与C18相近，但不具有次级相互作用，分析碱性化合物时不会发生拖尾。 6. 包括Silica 、氨基柱、氰基柱在内的正相色谱柱，分别通过硅羟基、胺基、氰基与分析物中的极性基团发生极性相互作用，从而实现对分析物的保留和分离，适用于极性化合物的分离，对许多同分异构体和结构类似物也能实现较好分离。 3、对填料的要求 1）填料类型 普通的硅胶键合相色谱柱在流动相pH 处于2～7.5范围时表现稳定，超出这一范围就会发生键合相水解(pH 7.5) 等现象，因而具体到那一款色谱柱的选择时，应保证填料所能耐受的pH 范围符合分析条件的要求。色谱耗材制造公司通过改进键合技术，已经制造出pH 适用范围较宽的硅胶键合相色谱柱，比如Diamonsil (2)能够耐受1.5～9的pH 值，可以满足绝大多数情况下的反相色谱分析。 PLRP 为聚合物基质的反相填料，由于不存在上述水解和溶解的危险，因而能够在各种PH 值下使用，是目前PH 值适用范围最宽的色谱柱，其主要缺点是柱效较低，重现性差、在有机相中易发生溶胀等。 2）填料粒径 目前分析中大多使用粒径为1.7～5 μm 的填料。根据速率理论，塔板高度与填料的粒径近似成正比，因而减小填料粒径可以得到更高的柱效，当分离效果不理想时可以考虑使用更细的填料；使用细粒径填料时，柱长可适当缩短，以提高分析速度；使用细粒径填料时，高的柱效有效抑制了色谱峰的展宽，能够获得较高的分析灵敏度；细粒径填料会显著增大柱压。 分析者可根据对柱效、分析时间和分析灵敏度的要求对填料粒径进行选择。 3）填料的孔径 填料的孔径对化合物的分子量具有限制。孔径为100 ?左右的填料仅能用于相对分子量不超过2000的化合物的分离，更大的分子难以进入孔内，在填料上的保留较弱，需要使用孔径更大的填料，比如300 ?。 4、色谱柱规格 (1) 内径 在理想情况下，当填料、柱长和流动相优化线速度确定时，色谱柱内径的变化将只影响上样量和灵敏度，柱效、分离度、分析时间等均不发生变化。与内径为4.6 mm 的色谱柱相比，内径为2.1 mm 的色谱柱的截面积仅相当于前者的1/5，所以为取得相同的线速度，后者所需的体积流速仅为前者的1/5，因而使用细径柱能显著减少溶剂用量；同样由于截面积小，样品组分在细径柱中的稀释也