分子生物学讨论课讨论题4.pptx

分子生物学次讨论(tǎolùn) 讨论题4 预防医学1403班 小组(xiǎozǔ)成员：01王璟 第一页，共35页。 讨论题目：已知目的基因的cDNA序列（GenBank登录号：AK135903.1），拟采用基因工程技术在哺乳动物细胞中表达该序列中的133-1941位核苷酸序列，请设计(shèjì)实验方案。第二页，共35页。1234我们(wǒ men)的方案：根据133-1941的序列，设计PCR引物从cDNA中扩增该序列得到扩增产物后将产物插入质粒该质粒扩增后转染哺乳动物细胞(xìbāo)，纯化后进行表达第三页，共35页。根据(gēnjù)133-1941的序列，设计PCR引物第四页，共35页。1234引物设计目的(mùdì)、原理及原则学习(xuéxí)使用GenBank有哪些信誉好的足球投注网站(sōu suǒ)、设计引物根据原则筛选引物第五页，共35页。引物设计(shèjì)的目的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板(múbǎn)DNA序列。引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。引物设计(shèjì)的原理1、 择合适的靶序列：设计引物之前，必须分析待测靶序列的性质，选择高度保守、碱基分布均匀的区域进行/doc/5388264.html引物设计。2、 长度：一般来说，/doc/6127469.html寡核苷酸引物长度为 15～30bp。?3、 Tm 值：引物的 Tm 值/doc/2099103.html一般控制在 55～60℃，尽可能保证上下游引物的 Tm 值一致，一般不超过 2℃。?4、 （G+C）含量：有效引物中（G+C）的比例一般为 40～60％。?5、 碱基的/doc/4133065.html随机分布：引物中四种碱基的分布最好是随机的，不存在聚嘌呤和聚嘧啶，尤其在引物的 3’端不应超过 3 个连续的 G 或 C。?6、 引物自身：引物自身不存在连续 4 个碱基以上的/doc/4147325.html互补序列，否则会影响到引物与模板之间的复性结合，尤其避免 3’末端的互补。 第六页，共35页。引物的设计原则(yuánzé)（详见课本P.164）① 引物应用核酸系列保守区内设计(shèjì)并具有特异性。② 产物不能形成二级结构。③ 引物长度一般在15~30碱基之间。④ G+C含量在40%~60%之间。⑤ 碱基要随机分布。⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。⑧ 引物5′端可以修饰。⑨ 引物3′端不可修饰。⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位。第七页，共35页。　GenBank 是一个有来自于70,000多种生物的核苷酸序列的数据库。每条纪录都有编码区（CDS）特征的注释，还包括氨基酸的翻译。GenBank属于一个序列数据库的国际合作组织(zǔzhī)，包括EMBL和DDBJ。可使用它找到靶序列。 第八页，共35页。1.从/nuccore/网站中对该基因进行(jìnxíng)有哪些信誉好的足球投注网站，输入登录号：AK135903.1第九页，共35页。2.查询可知(kě zhī)其序列为第十页，共35页。3.直接在genbank中得到的引物序列(xùliè)结果pair3、pair5的3端有三个连续(liánxù)的碱基，舍去。pair1的3端末尾有碱基A，舍去。第十一页，共35页。pair6，pair7的3端末尾是碱基A，舍去。所以(suǒyǐ)，可用的引物序列为：pair2、pair4第十二页，共35页。/tools/primer-blast//tools/primer-blast/有哪些信誉好的足球投注网站(sōu suǒ)引物第十三页，共35页。第十四页，共35页。点击 get primers后得到不同(bù tónɡ)的引物方案第十五页，共35页。从cDNA中扩增该序列(xùliè)第十六页，共35页。一、PCR（1）取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA ? 2 μl；上游引物（10 pM）2 μl；下游引物（10 pM）2 μl；dNTP(2 mM) 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl）1 μl；??（2）加入适量的ddH2O，使总体积达50 μl。轻轻混匀，离心；??（3）设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠(kěkào)与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照；??（4）电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；??（5）密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。第十七页，共35页。二、利用PCR技术(jìshù)扩增目的