分子生物学课件PCR.pptx

PCR:polymerasechainreaction聚合酶链式反应(liàn shì fǎn yìng) 第一页，共55页。 PCR技术是一种体外模拟体内DNA复制过程的核酸扩增技术。它是以待扩增的双链DNA为模板，以一对人工合成的寡核苷酸为引物，以四种dNTP为底物，通过耐高温DNA聚合酶的酶促作用(zuòyòng)，经过“变性、退火、延伸”三步反应的循环快速特异地扩增出特定的DNA片断。 第二页，共55页。PCR技术(jìshù)的基本原理 由“高温变性(biànxìng)、低温退火和适温延伸反应”组成一个周期，循环进行，使目的基因得以迅速扩增。第三页，共55页。95℃PCR循环(xúnhuán)过程模板(múbǎn)DNA第四页，共55页。DNA引物50℃PCR循环(xúnhuán)过程引物1引物2第五页，共55页。DNA引物72℃PCR循环(xúnhuán)过程Taq酶引物1引物2Taq酶第六页，共55页。95℃PCR循环(xúnhuán)过程第1轮结束(jiéshù)第2轮开始(kāishǐ)第七页，共55页。PCR循环(xúnhuán)过程95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq第八页，共55页。PCR循环(xúnhuán)过程72℃第2轮结束(jiéshù)第九页，共55页。PCR循环(xúnhuán)过程模板(múbǎn)DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第6轮扩增第5轮扩增第十页，共55页。PCR的反应(fǎnyìng)动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止(jìngzhǐ)期，即出现“停滞效应”，这种效应期称平台期。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。第十一页，共55页。模板—— 3’TTAGGCCTGGATAAGCGCCTGGA 5’TaqDNA聚合酶引物—— 5’ATCCGGAC Mg2+dTTPdGTPdATP底物dCTP PCR扩增体系(tǐxì)第十二页，共55页。 PCR 反应(fǎnyìng)体系PCR反应五要素：引物、酶、dNTP、模板(múbǎn)和Mg2+ 标准的PCR反应体系：　10×扩增缓冲液 　 10ul　4种dNTP混合物 　 各200umol/L　引物 　　　　 　 各10～100pmol　　模板(múbǎn)DNA 　　　 　 0.1～2ug　 Taq DNA聚合酶 　 2.5u　　Mg2+　　　　　　 1.5mmol/L　加双或三蒸水至 　 100ul第十三页，共55页。3’ 3’ 引物 引物是人工合成的两段寡核苷酸单链，是PCR特异性反应的关键(guānjiàn)，扩增产物的大小也由特异引物限定。第十四页，共55页。设计引物应遵循以下原则：①引物长度： 15-30bp，常用为20-27bp左右。在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。②引物碱基： G+C含量以40-60%为宜，过高或过低均不利于引发。ATGC最好随机分布，避免聚嘌呤或嘧啶核苷酸。③避免引物自身互补，形成发夹结构，因空间位阻而影响其与模板结合(jiéhé)。两条引物间之间也不能互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带或降低引物有效浓度。第十五页，共55页。④引物3’端的碱基，应严格要求配对，不可修饰，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。考虑到密码子的简并性，引物3′端不终止于密码子第三个碱基。因该位置由于密码子的简并性影响扩增的特异性。 引物的5‘端可以修饰，它对扩增特异性影响不大。如增加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛等；引入点突变(tūbiàn)、启动子序列等。⑤引物的特异性： 引物应该与核酸序列数据库的其它序列无明显的同源性，以减少引物与基因组的非特异性结合。第十六页，共55页。简并引物简并性(degeneracy) 遗传(yíchuán)密码中，除色氨酸和蛋氨酸仅有一个密码子外，其余氨基酸均有多个密码子。 如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个(yī ɡè)或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。 第十七页，共55页。例如， 序列1：tg a atgcatgcatgc 序列2：tg c atgcatgcatgc 序列3：tg t atgcatgcatgc 若样品并不能明确是1，2还是3，为了能从不确定序列来源的样本中，扩增出同源序列来，你的引物实际上就是针对序列1，2，3设计的混合物。这样(zhèyàng)不论是1，