核酸分析技术.pptx

核酸分析技术第1页/共43页琼脂糖凝胶电泳样品的电荷效应 带电多，迁移快凝胶的筛选效应 分子量小，阻力小，迁移快主要用于分离鉴定核酸第2页/共43页琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等第3页/共43页_+Power第4页/共43页琼脂糖凝胶电泳分离DNA凝胶制备上样电泳染色结果观察第5页/共43页琼脂糖凝胶电泳分离DNA 凝胶制备浓 度（%）标 准(kb)高强度(kb)低熔点(kb)低黏度低溶点(kb)0.31~500.50.7~250.80.5~150.8~100.8~101.00.25~120.4~80.4~81.20.15~60.3~70.3~71.50.08~40.2~40.2~42.00.1~30.1~33.00.05~10.5~14.00.1~0.56.00.01~0.1第6页/共43页不同类型琼脂糖的性质 琼脂糖类型凝结温度/℃熔化温度/ ℃ 标准琼脂糖35~3890~95不同厂家生产的不同商品其凝结温度和熔化温度有一定差异40~4285~90 高强度琼脂糖34~4385~95 修饰的低熔点/ 凝点琼脂糖25~3563~653565 超低熔点8~1540~45 低黏性低熔点琼脂糖25~307038853075第7页/共43页电泳缓冲液常用三种缓冲液 Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)、Tris-磷酸(TPE)TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀TAE：缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TAE。缓冲液中的 EDTA 可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解第8页/共43页琼脂糖凝胶电泳分离DNA 凝胶制备加热前加热后第9页/共43页琼脂糖凝胶电泳分离DNA2. 上样第10页/共43页核酸电泳的上样缓冲溶液三个作用：1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内；2）使样品带有颜色便于简化上样过程；3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。第11页/共43页6×凝胶载样缓冲液类型6 ×缓冲液贮存温度I0.25%溴酚蓝4℃0.25%二甲苯氰FF40% (m/V)蔗糖水溶液II0.25%溴酚蓝室温0.25%二甲苯氰FF15% Ficoll(Type400)水溶液III0.25%溴酚蓝4℃0.25%溴酚蓝%二甲苯氰FF30%甘油水溶液IV0.254℃40% (m/V)蔗糖水溶液第12页/共43页核酸电泳的指示剂指示剂：溴酚兰、二甲苯青溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色，电泳中，溴酚兰的迁移率与双链线性DNA片段二甲苯青：水溶液呈兰色，电泳时，其迁移速率与双链线性DNA大致相当琼脂糖凝胶浓度0.6%1%1.4%2%迁移率1Kb0.6Kb0.2Kb0.15Kb琼脂糖凝胶浓度1%1.4%迁移率2Kb1.6Kb第13页/共43页琼脂糖凝胶电泳分离DNA3. 电泳第14页/共43页琼脂糖凝胶电泳分离DNA4. DNA染色溴化乙锭第15页/共43页核酸电泳的染色剂——溴化乙锭一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光可在凝胶电泳液中加入终浓度为的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般5ng溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察ethidium bromide，EB第16页/共43页第17页/共43页琼脂糖凝胶电泳分离DNA5. 结果观察第18页/共43页第19页/共43页DNA的迁移速率决定因素第20页/共43页 1 DNA分子的大小 双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比； 2 琼脂糖浓度 浓度越低，相同核酸分子迁移越快； 第21页/共43页 3 DNA的构象 超螺旋环状＞线状＞切口环状。 4 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。第22页/共43页 5 所用的电压 低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。 6 琼脂糖种类 常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖；第23页/共43页聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶是由丙烯酰胺聚合而成样品的电荷效应和凝胶的筛选效应是分离的主要依据第24页/共43页（一） 聚丙烯酰胺凝胶的本质 在TEMED (四甲基乙二胺) 催化过硫酸铵还原产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基