核酸分子杂交七年制.pptx

核酸分子杂交七年制第1页/共49页核酸分子杂交（nucleic acid molecular hybridization）是指用标记的已知DNA或RNA片段检测样品中未知核酸序列，通过碱基互补配对原则发生同源性结合，再经显影或显色的方法，将结合的核酸序列的位置或大小显示出来。探针( probe )：带有可检测标记的已知序列的DNA或RNA片段。第2页/共49页检测对象: 克隆化的基因组DNA,、细胞总DNA、总RNA。杂交方法不同，被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交, 即细胞原位杂交。核酸分子杂交特点：高度的灵敏性(pg) 、高度的特异性应用：克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。目前核酸分子杂交不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用, 而且在临床基因诊断上的应用也日趋增多。 第3页/共49页第一节 核酸分子杂交的基本原理一、变性（denaturation）二、复性（renaturation）三、杂交（hybridization）四、预杂交（prehybridization）第4页/共49页 基本原理：DNA变性、复性与分子杂交第5页/共49页Hybridization第6页/共49页Tm ：50%DNA解链的温度，又称融解温度。 （G、C含量）Tm = 69.3 + 0.41*(G +C) % Tm=4 ℃ X（G + C）+ 2℃ X（A + T）融解温度：50％杂化核酸分子解链温度称为寡核苷酸探针的Tm值。寡核苷酸探针的长度、碱基的含量和核酸的序列决定了探针的Tm值。实际操作中，常选择低于Tm值5-10℃进行杂交。第7页/共49页杂交温度：M（G + C）% - 500/n（甲酰胺%）M为Na+摩尔浓度，n为探针的复杂性甲酰胺是一种变性剂，能干扰碱基堆积力和氢键的形成，降低核酸杂交的Tm值，50%的甲酰胺可以使Tm降低30℃ 例如，一个长度为500bp的探针，（G+C）含量为50%，杂交体系中含5 X SSC（+）和50%甲酰胺，则其Tm值为： Tm=81.5℃ + (-2.07) + 20.5 – 1 – 30.5=68.4 ℃ 50%甲酰胺溶液, 温度一般选择低于 Tm值20-25℃杂交温度应:68.4 ℃ - 25 ℃=43.2 ℃3’第8页/共49页3’5’5’3’3’5’5’影响核酸分子杂交的因素探针的浓度、长度、复杂性离子强度温度与变性剂（甲酰胺）杂交条件的严谨性 第9页/共49页预杂交prehybridization概念：为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，在杂交前用封闭物将这些非特异性位点封闭。这一杂交前的处理过程称为预杂交。常用的封闭物：（1）变性的非特异性DNA:如鲑鱼精DNA、小牛胸腺DNA，又称为覆盖DNA。（2）高分子化合物：Denhardt溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖400 、脱脂奶粉第10页/共49页electrophoresisTransferblocksubstrateBlockprobe基本实验步骤：Migrationhybridization第11页/共49页第二节 核酸探针probe：带有可检测标记的已知DNA或RNA片段，用于检测待测样品中的靶核酸序列。 核酸探针的类型 核酸探针的标记方法 核酸探针的检测 第12页/共49页核酸探针的类型按化学本质分：DNA探针 RNA探针 按标记物分：放射性标记探针 3H、32P、35S、125I等优点：高特异性，高灵敏度缺点：存在放射性污染，半衰期短非放射性标记探针生物素，地高辛、荧光素等第13页/共49页常用的探针标记法： （1）化学标记法：光敏生物素标记法（2）酶促标记法： 将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后利用酶学的方法将标记物掺入到探针分子上。 切刻平移法、随机引物法、末端标记法等第14页/共49页 （1）化学标记法：通过分子上的活性基团直接将标记物结合到核酸分子上.光敏生物素标记法:强光10-20分钟，光敏基团与核酸探针的磷酸基团以共价键结合。第15页/共49页32P或35S同位素标记的单核苷酸（2）酶促标记法： 将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后利用酶学的 方法将标记物掺入到探针分子上。 缺口平移法、随机引物法、末端标记法等dig-dUTP的结构第16页/共49页（1）缺口平移法由DNA酶Ⅰ和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ共同完成。（nicktranslation）DNA酶Ⅰ：在双链DNA上随机打开若干个单链缺口，产生3’-OH端大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ：5’→3’DNA聚合酶活性； 5’→3’外切核酸酶活性“边切除、边聚合”第17页/共49页最合适的缺口平移片段一般为50-500个核苷酸。DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶Ⅰ的质