很详细的载体转化计划借鉴.pdf

《PCV-2衣壳蛋白的原核表达》实验计划 1. 实验目的 获得较纯的具有反应原性的抗原，建立间接 ELISA方法。为 PCV-2单抗杂 交瘤细胞的筛选提供方法。 2. 技术路线 ORF2基因片段 质粒载体 酶切 酶切 、连接 重组质粒 转 入 感受态大肠杆菌 挑 斑 获得重组质粒的大肠杆菌 IPTG 诱导 纯化 目的蛋白 3. 实验材料与方法 3.1 材料 IPTG 贮存液 （20%，w/v ，800mmol/L ）：8ml 蒸馏水溶解 2g IPTG，蒸馏水定容至 10ml 。0.22um 滤器除菌。分装成 1ml 小份， -20 ℃贮存。 氨苄青霉素 (Amp)贮存液 : 按 100mg/ml 比例将 Amp粉剂溶于去离子水中， 过滤除菌， 分装， -20 ℃冻存。 X-gal 贮存液 (20mg/ml): X-gal 20mg 溶于 1ml 二甲基甲酰胺中， -20 ℃避光保存。 LB 液体培养基 : Tryptone l0g Yeast Extract 5g NaCl l0g 在 1000ml 的容量瓶中， 称量上述成分， 加入去离子水 950m1溶解， NaOH调 pH 值至 7.4 ， 定容至 1000ml ， 121℃高压灭菌 20min 。 LB 固体培养基 : 琼脂粉 1.5g 溶于 100m1液体培养基中， 121℃高压灭菌 20min ，冷却至 50℃ 左右，浇制平板。 Amp/LB 液体培养基 : 于 LB 液体培养基中，加入 Amp贮存液使终浓度为 100ug/ml 。 Amp/LB 固体培养基 : 琼脂粉 1.5g 溶于 100m1液体培养基中， 121℃高压灭菌 20min ，冷却 至 50℃左右，加入 Amp至终浓度为 100ug/ml ，浇制平板。 Amp/LB/X-gal/IPTG 平板 : 在制备好的 Amp/LB 平板上加 40u1 X-gal(20mg/ml) 和 7u1 IPTG(200mg/ml) ，用灭菌 L 型涂布器均匀涂布于平板表面， 37 C 温育至完全吸收。 BamHI 酶 XhoI 酶 DNA胶回收试剂盒 T4 DNA 连接酶 质粒提取试剂盒 2 2 2 0.lmol/L CaCl 溶液 : CaCl .2H O 1.47g 溶于 100m1去离子水中，过滤除菌，分装， -20 ℃ 贮存。 甘油 30%丙烯酰胺 (w/v): 丙烯酰胺 29g, N-N ’二甲基甲叉双丙烯酰胺 1g，去离子水定容至 100ml，pH 不能超过 7.0 ，过滤， 4 ℃于棕色玻璃瓶贮存。 1.5mo1/L Tris-HCl (pH8.8): Tris- 碱 18.17g 溶于 80m1去离水中，加入约 3m1 的浓盐酸