DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和操作步骤.pdf

一、实验目的 琼脂 糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，学习 DNA 琼脂 糖凝胶电泳的使用技术，掌握有 关的技术和识读电泳图谱的方法。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定 DNA 、RNA 分子混合物的方法，这种电泳方法以 琼脂凝胶作为支持物， 利用 DNA 分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物 的目的。 DNA 分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场 强度下， DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响 因素。DNA 分子的迁移速度与其相对分子量成反比。 不同构型的 DNA 分子的迁移速度不同。 如环形 DNA 分子样品， 其中有三种构型的分子： 共价闭合环状的超螺旋分子 （cccDNA ）、 开环分子 (ocDNA) 、和线形 DNA 分子 (IDNA) 。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度 大小顺序为 :cccDNA ＞IDNA ＞ocDNA 核酸分子是两性解离分子， pH3.5 是碱基上的氨基解离， 而三个磷酸基团中只有一个磷酸解 离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而 pH8.0-8.3 时，碱基几乎不解离，而磷酸 基团解离， 所以核酸分子带负电， 在电场中向正极泳动。 不同的核酸分子的电荷密度大致相 同，因此对泳动速度影响不大。在中性或碱性时，单链 DNA 与等长的双链 DNA 的泳动率 大致相同。 影响核酸分子泳动率的因素主要是： 1、样品的物理性状 即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。一般而言，电荷密度愈大，泳动率越大。但 是不同核酸分子的电荷密度大致相同，所以对泳动率的影响不明显。 对线形分子来说，分子量的常用对数与泳动率成反比，用此标准样品电泳并测定其泳动率， 然后进行 DNA 分子长度（ bp ）的负对数 —— 泳动距离作标准曲线图，可以用于测定未知分 子的长度大小。 DNA 分子的空间构型对泳动率的影响很大，比如质粒分子，泳动率的大小顺序为： cDNA ＞IDNA ＞ocDNA 但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响，会出现 相反的情况。 2 、支持物介质 核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质，琼脂糖是一种聚合链线性分子。 含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同， 是于分离不同浓度范围的核酸 分子。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（ Acr ）在 N,N,N′- 四甲基乙四胺（ TEMED ）和过硫酸铵 （AP ）的催化下聚合形成长链， 并通过交联剂 N,N′-亚甲双丙烯酰胺 （Bis ）交叉连接而成， 其网孔的大小由 Acr 与 Bis 的相对比例决定。 琼脂糖凝胶适合分离长度 100 至 60 的分子，而聚丙烯酰胺凝胶对于小片段（ 5bp-500bp ） 的分离效果最好。选择不同浓度的凝胶，可以分离不同大小范围的 DNA 分子。 3 、电场强度 电场强度愈大， 带点颗粒的泳动越快。 但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小， 所以电 泳时一般采用低电压，不超过 4V/cm 。而对于大片段电泳，甚至用 0.5-1.0V/cm 电泳过夜。 进行高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。 4 、缓冲液离子强度 核酸电泳常采用 TAE 、 TBE 、TPE 三种缓冲系统，但它们各有利弊。 TAE 价格低廉，但缓 冲能力低， 必须进行两极缓冲液的循环。 TPE 在进行 DNA 回收时，会使 DNA 污染磷酸盐， 影响后续反应。所以多采用 TBE 缓冲