钙成像实验操作及数据处理.ppt

刘丝丝 2017年8月25日 钙成像实验操作及数据处理 钙成像实验操作 1.钙成像原理  基本原理：利用钙离子指示剂监测组织或细胞内钙离子浓度，进而反映组织或细胞内某些活动或反应 钙离子指示剂：能够指示钙离子的可视化物质 2. 实验操作  操作步骤： （1）Fluo-4工作液配制： 每管Fluo-4 AM：+8μlDMSO +2μlF-127 （2）Fluo-4工作液使用： 储液稀释1000倍使用（倍稀释数可根据实验调节）：1mlDMEM+1μlFluo-4工作液 主要试剂及仪器： Fluo-4指示剂，DMSO，F-127，DMEM，HBSS，荧光显微镜或激光共聚焦显微镜 2. 实验操作  （3）Fluo-4指示剂孵育： 将培养皿中原培养基弃去，加入500-1000μlFluo-4溶液，37℃孵育20min。 （4）清洗： 将Fluo-4溶液弃去，用不含有钙、镁离子的HBSS溶液清洗3遍，每次2-3min，最后加上相应的浴液开始拍摄。 （5）钙离子成像： 使用普通荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜进行拍摄。 以Leica SP5的CLSM为例： 激发光：488nm 采用xyt时间轴拍摄模式：Time interval：3s；Frames：200（根据实验而定）。  钙成像数据处理 必备软件  Image J MATLAB Origin Photoshop Adobe Illustrator 1.图片处理，采集数据 soft stiff stiff stiff soft soft 1.1.新建⽂件夹X，将待分析的组图⽂件（200张）考⼊⽂件夹X中1.2.导⼊图⽚：打开Image J 后， File ---- Import ---- Image sequence（会弹出新框Sequence Options , 点OK）1.3.变换颜色： Image ---- Lookup Tables ---- 16_colors（注意：如果是彩色的先转成灰度图）1.4.调对⽐度： Image ---- Adjust ---- Brightness /Contrast（会弹出新框BC,将图⽚调节到最佳） ----Apply（会弹出新框Apply LUT to all 200[image numbers] slices in the stack? Choose YES）  1.图片处理，采集数据 soft stiff stiff stiff soft soft 1.5.选细胞： Analyze ---- Tools ---- ROI Manager（会弹出新框ROI Manager） ---- 把Show all and Labels 前⾯打钩 ---- 主菜单栏⾥选择选择不同形状⼯具圈细胞（PS.先选择背景，再选择细胞） ---- 每圈⼀个细胞后点Add ---- 圈完所有细胞后截屏保存图⽚（PS.保存了标记细胞个数和顺序）⾄新建⽂件夹X中 1.6.数据导出： ROI Manager ---- More ---- Multi Measure （会弹出新框Multi Measure）---- 将Measure All 200[image numbers] Slices打钩 ---- OK ---- Results（会弹出新框Results） ----File ---- Save as（将Results数据保存为Excel格式命名Results.xls⾄新建⽂件夹X中）   1.图片处理，采集数据 soft stiff stiff soft soft 1.7.在⽂件夹X中，新建⼀个Excel⽂件，将数据粘贴⾄新的Excel中命名为Results1.xls，只保留编号、 Mean、 Slice三列，将Area列删除1.8.Close the program Image J   在Analyze里面的Set Measurements可以设置Mean值 2.Matlab数据处理 soft stiff stiff soft soft 2.0. start the program Matlab 2.1.复制程序：将程序⽂件CalciumFlom拷⼊新建⽂件夹X中，此时⽂件夹X中应包括：原始图⽚⽂件夹、截屏图⽚、 Results.xls、 Results1.xls、 CalciumFlom2.2.导⼊⽂件夹X：打开Matlab后，点右上⾓按钮…， 会弹出新框浏览⽂件夹，选中需导⼊的⽂件夹X后点确定，此时Matlab程序左侧会出现Current Folder，列出了⽂件夹X中所有⽂件2.3.双击打开⽂件夹X中新建的Excel⽂件Results1.xls（切勿打开原Excel⽂件