高效液相色谱法培训.ppt

 高效液相色谱法;高效液相色谱法（HPLC）是60年代末以经典液相色谱法为基础，引入了气相色谱的理论与实验方法，流动相用高压泵输送，采用高效固定相和在线检测等手段发展而成的分离分析方法 。 与气相色谱法相比具有：适用范围广，样品预处理简单，分离效率高，流动相选择范围广，检测方法多为非破坏性的，流出组分可回收等优点。;HPLC;正相色谱（normal phase） 流动相极性小于固定相极性的分配色谱法称为正相分配色谱。常用的分析柱有: 氨基柱、氰基柱、硅胶柱。 常用流动相为极性小的有机溶剂。 反相色谱（reversed phase） 流动相极性大于固定相极性的分配色谱法称为反相分配色谱法。常用的分析柱有：ODS( C18)， C8， C2。 常用流动相为甲醇-水，乙腈-水。 ;离子抑制色谱（ion suppression chromatography）——调节流动相的pH值，抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的目的。 离子对色谱（ion pair chromatography）——将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物，从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度，改善分离效果，达到分离目的。 常用反离子有：季铵盐 ——用于酸类 烷基磺酸盐——用于碱类;离子色谱法（ ion chromatography ） 离子色谱是由经典的离子交换色谱发展起来的一种液相色谱技术，利用物质在离子交换柱上迁移的差异而达到分离，用于亲水性阴阳离子的测定。根据是否采用抑制柱，可分为抑制型离子色谱和非抑制型离子色谱。;空间排斥色谱（steric exclusion ?） 也称凝胶色谱，依据被分离组分分子尺寸与凝胶空径大小之间的相对关系而分离，类似于分子筛作用。在一定分子线团尺寸内，分子越大，保留时间越短。 凝胶渗透——以有机溶剂为流动相 凝胶过滤——以水溶液为流动相 对于相同化学组成的高分子化合物，其分子尺寸大小与分子量成正比，因此凝胶色谱可以研究高分子化合物的分子量分布。;胶束色谱(micellar chromatography) 表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓度）时，多余的表面活性剂不再溶解，聚集而成胶束（胶粒??。 以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶束色谱法。它的流动相为胶束多相分散体系，不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。 因胶束色谱法的流动相是多相分散体系，在整个色谱体系中又增加了一相，故也被称为假相色谱（pseudo phase chromatography）。;手性色谱(chiral chromatography) 用于分离手性药物对映体的一种有效技术，可分为直接法和间接法两类： 直接法 手性固定相法（chiral stationary phase;CSP) 手性流动相法(chiral mobile phase additive;CMPA) 间接法—手性试剂衍生化法 chiral derivatization reagent,CDR);;高效液相色谱仪组成;;13;启动液相色谱仪器的流程 ;液相柱---保留值与pH的关系;2. 流动相类别;对溶剂的要求;不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质要求越高放置时间越短。 理想的HPLC用水应为18.2Ω的超纯水，并通过0.22um的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。 ;过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。 脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响： 1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动 ;20;21;流动相的保存;流动相的保存;1．梯度洗脱的特点;2．梯度洗脱的主要条件;26;梯度：低压混合;梯度滞后：系统体积的影响;梯度滞后大小的影响;滞后体积变化的影响;输液泵 多用柱塞往复泵，柱塞向前运动，液体输出，流向色谱柱；向后运动，将贮液瓶中液体吸入缸体。如此往复运动，将流动相 源源不断地输送到色谱柱中。 柱塞往复泵属于恒流泵，流量不受柱阻影响，泵压最高为400kg/cm2。 这种泵具有清洗容易，更换流动相方便等优点，但脉动性较大是其缺点。目前多采用双泵补偿法来克服这一问题。;;避免使用对不锈钢有腐蚀性的溶剂。 例：硝酸、硫酸、盐酸、卤化物， 四氯化碳与异丙醇或四氢呋喃的混 合物，含强络合剂的溶液等。;;;;进样阀;;注意：使用后应清洗！;进样注意点 进样阀的废液出口端高度必须与进样针在同一水平位置，以免虹吸作用，使样品向针筒方