高效液相色谱分类及工作原理.ppt

第三章 高效液相色谱法 High Performance Liquid Chromatography，HPLC ;生物材料和生物体液是目前所知道撮复杂的化学物质的混合物，所含成分在一万种以上，其分子量从18到几百万，而且其中有意义的化学成分的含量又往往很低，因此，必须要有一种高分辨、高灵敏度的分离鉴定手段，气相色谱和高压液相色谱具有以上特点，它们可通过对生物样品和生物体液样品的有关成分的提取、分离、分析定量，进行对疾病的早期快速诊断的研究，病理病因的研究，以及药物在体内代谢的研究……等。;高压液相色谱对于挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合物以及离子型化合物的分离尤为有利。如氨基酸、多肽、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、类脂、维生素、抗菌素等均可进行分离分析定量。;第一节 高效液相色谱法概述;;;;一、理论基础：速率理论;二、HPLC技术;㈠经典LC与HPLC比较;㈡与气相色谱法比较，HPLC的优点; ⒉流动相对分离起作用 气相色谱的流动相仅起运载作用，对组分不产生相互作用力；HPLC的流动相对组分产生相互作用力，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数。 ;⒊经常在室温条件下操作 气相色谱法一般在较高温度下进行 缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格。;第二节 HPLC的主要类型;1．分离原理 液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。 ;2.固定相;（2）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体）：由直径为30 ~ 40?m的实心玻璃球和厚度约为1 ~ 2 ?m的多孔性外层所组成。目前，这种载体粒度为5 ~ 10 ?m。 ;⑶化学键合固定相：它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。 它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破。它是目前应用最广泛的一种固定相。 据统计，约有3/4以上的分离问题是在化学键合固定相上进行的。;3．流动相;二、液一固吸附色谱法(LSAC);1．分离原理;达平衡时,有 ;2．固定相;3.流动相;三、离子交换色谱法（IEC）;1．离子交换原理;阳离子交换：;达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交???反应的选择系数）：;2.固定相;（4）离子交换键合固定相 它是用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。它也分为两种类型。一种是键合薄壳型，其载体是薄壳玻珠。另一种是键合微粒载体型，它的载体是多孔微粒硅胶。后者是一种优良的离子交换固定相，它的优点是机械性能稳定，可使用小粒度固定相和高柱压来实现快速分离。 ;3.流动相;盐离子的浓度影响：; 要视不同情况而定。例如，分离有机酸和有机碱时，这些酸碱的离解程度可通过改变流动相的pH值来控制。增大pH值会使酸的电离度增加，使碱的电离度减少；降低PH值，其结果相反。但无论属于哪种情况，只要电离度增大，就会使样品的保留增大。;四、离子对色谱法（IPC）; 由于离子对化合物A-B+具有疏水性，因而被非极性固定相（有机相）提取。组分离子的性质不同，它与反离子形成离子对的能力大小不同以及形成的离子对流水性质不同，导致各组分离子在固定相中滞留时间不同，因而出峰先后不同。这就是离子对色谱法分离的基本原理。;流动相：加有平衡离子（反离子）的极性 溶液通过改变流动相的pH、平 衡离子的浓度和种类可改变分离 的选择性。 ;五、离子色谱法（IC）; ;⒉离子色谱连续抑制装置图：; 通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相，从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量。 若样品为阳离子，用无机酸作流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂。当试样经阳离子交换剂的分离往后，随流动相进入抑制柱，在抑制柱中发生两个重要反应：;R+－OH＋H+Cl- -→R+－Cl十H2O R+一OH-＋M+Cl--→M+OH－＋R+－Cl-;⒊离子色谱的应用：; ;六、空间排阻色谱法（SEC）;1.固定相;（1）软性凝胶 如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小的交联结构，其微孔能吸入大量的溶剂，并能溶胀到它们干体的许多倍。它们适用以水溶性溶剂作流动相，一般用于小分