核酸电泳与检测.pptx

1;;1.基本原理 ;;;;;（4）凝胶电泳的分辨力与凝胶的类型和密度相关 一、凝胶类型 1.琼脂糖凝胶的分辨力在～50Kb之间(＜20kb);可区分相差loobp的DNA片段， 常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。 2. 聚丙烯酰胺凝胶用于分离5－500bp的片段;垂直装置进行电泳 效果好、分辨率极高，相差1bp的DNA片断就能分开，能容纳相对大量的DNA 用于核苷酸多态性的分析 ;不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围;;2.影响DNA在凝胶中迁移速率的因素： ;;;;;;;3.琼脂糖凝胶电泳;;;;;;（2）琼脂糖凝胶中DNA的检测;凝胶的EB染色; （3）EB使用时的配制、贮存及使用 EB常用水配制成10 mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5 μg/ml 。 （4）当要知道DNA片段准确大小时，凝胶应在无EB情况下电泳，电泳结束后再用EB染色。 ;EB替代品;;;（3）结果分析;琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡过程中 DNA Ladder的形成;;4.注意事项;5.常见问题与对策;;;;浓度和纯度的测定;（2）分光光度法 DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处。 波长为260nm时，DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。 对标准样品来说，浓度为1μg / ml时，DNA钠盐的OD260＝ 当OD260＝1时，dsDNA浓度约为50μg / ml ?????????????? ssDNA浓度约为37μg / ml ?????????????? RNA浓度约为40μg / ml ?????????????? 寡核苷酸浓度约为30μg / ml（由于底物不同有差异;;;操作步骤 1、? UV-240紫外分光光度计开机预热10min. 2、? 用重蒸水洗涤比色皿，吸水纸吸干，加入TE缓冲液后，放入样品室的S池架上，关上盖板。 3、? 设定狭缝后校零。 4、? 将标准样品和待测样品适当稀释（DNA5μl或RNA4μl用TE缓冲液稀释至1000μl）后，记录编号和稀释度。 5、? 把装有标准样品或待测样品的比色皿放进样品室的S架上，关闭盖板。 6、? 设定紫外光波长，分别测定230nm、260nm、280nm波长时的OD值。 7、? 计算待测样品的浓度与纯度。 DNA样品的浓度（μg / μl）:OD260×稀释倍数×50/1000 RNA样品的浓度（μg / μl）：OD260×稀释倍数×40/1000;; 基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是，因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解；另外，因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。 ;;1.基本原理 ;;;;;3.琼脂糖凝胶电泳;（2）分光光度法 DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处。 波长为260nm时，DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。 对标准样品来说，浓度为1μg / ml时，DNA钠盐的OD260＝ 当OD260＝1时，dsDNA浓度约为50μg / ml ?????????????? ssDNA浓度约为37μg / ml ?????????????? RNA浓度约为40μg / ml ?????????????? 寡核苷酸浓度约为30μg / ml（由于底物不同有差异;操作步骤 1、? UV-240紫外分光光度计开机预热10min. 2、? 用重蒸水洗涤比色皿，吸水纸吸干，加入TE缓冲液后，放入样品室的S池架上，关上盖板。 3、? 设定狭缝后校零。 4、? 将标准样品和待测样品适当稀释（DNA5μl或RNA4μl用TE缓冲液稀释至1000μl）后，记录编号和稀释度。 5、? 把装有标准样品或待测样品的比色皿放进样品室的S架上，关闭盖板。 6、? 设定紫外光波长，分别测定230nm、260nm、280nm波长时的OD值。 7、? 计算待测样品的浓度与纯度。 DNA样品的浓度（μg / μl）:OD260×稀释倍数×50/1000 RNA样品的浓度（μg / μl）：OD260×稀释倍数×40/1000;感谢您的观看。