气相色谱法简易教程.pptx

1;背景;色谱法的基本原理;;色谱的基本概念;分配系数 可由Langmuir方程得出 Kd---分配系数 q、c---溶质在固相和液相中的浓度 ;保留时间（tR）和保留体积（VR） 反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一。 ;分离度:又称分辨率，用来表示两种洗脱曲线相邻的溶质相互分离的程度。 ;阻滞因子Rf 阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0）的迁移率之比 其意义在于体现某一种溶质与固定相之间???亲和力大小.;洗脱体积 色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积 不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异。;理论板，理论板当量高度（HETP），理论塔板数（N）、 反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系。 理论板：将溶质达到一次分配平衡的色谱柱段。 理论板当量高度：该段色谱柱的高度。 ;理论板数的计算方法;22.2 色谱分离方法的分类;第13页/共94页;按操作形式不同分类： 柱色谱：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。 纸色谱：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。 薄层色谱：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸色谱类似的方法进行物质的分离和鉴定。 纸色谱和薄层色谱主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通常为一次性使用，而柱色谱是常用的色谱形式，适用于样品分析、分离。生物化学中常用的凝胶色谱、离子交换色谱、亲和色谱、高效液相色谱等都通常采用柱色谱形式。;按分离的压力 高压色谱 中压色谱 低压色谱 按流动相分 气相色谱 液相色谱 超临界流体色谱;22.3 各类色谱技术及应用 ;凝胶过滤技术;第18页/共94页;分子筛凝胶色谱原理;分离关系：组分0的M最大，不能进入gel，洗脱体积为空隙体积V0；组分t的M最小，能进入到gel的细孔中，其洗脱体积接近柱体积Vt, 组分1-2在V0-Vt之间. 显然，GFC能分离洗脱体积在V0-Vt之间的组分。对于组分1和2，两峰距离 ;;第22页/共94页;凝胶介质特征参数 排阻极限(exclusion limit)：指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的M。如，Sephadex G50的排阻极限为30kD。 分级范围(fractionation range)：能阻滞组分并且使组分相互之间得到分离的组分分子量范围。如， Sephadex G50的分级在内。 溶胀率/吸水率： 如，Sephadex G50的溶胀率 = 500 ± 30%。 ;凝胶粒径：软gel粒径较大，在50-150?m之间；硬gel较小，在5-50?m之间。粒径越小，HETP越小，分离效率越高。 床体积(bed volume)：1g干燥gel溶胀后所占有的体积。如， Sephadex G50的床体积为9-11 cm3/g干胶。 空隙体积(void volume)：凝胶之间的空隙体积，即V0。 空隙体积一般用平均分子量在2000KD水溶性蓝葡聚糖(blue dextran)测定。;4)影响GFC分离特性的因素 线速度： 1st HW40F凝胶的排阻极限小，在该凝胶中蛋白质的m = 0，故HETP = 2Dz/u (Dz ? udp) = 常数。 2nd HW55F凝胶的排阻极限较大，在此，m 0, HETP ? u; 在u = 0处，直线交于点 2Dz/u。 3rd 当u 0.2 cm/min, NaCl的HETP随流速降低急剧增大。这主要由于分子的扩散影响。 ;进样体积： 1st 在一定相对料液体积范围内，HETP为常数； 2nd 但一定时间之后，HETP随料液相对体积的增加而急剧增大。 3rd 意义：为得到较高的分离度，料液体积需根据溶质的m差别控制在适当的范围内，在不影响分离度的前提下取最大值。 料液浓度 依据GFC的原理，tr和HETP与浓度无关。但实验表明，当浓度较高时，洗脱曲线出现吐舌、拖尾、甚至双峰；使HETP极度上升。这主要为样品黏度高造成。经验表明，料液与流动相的黏度比应控制在2以内。;分子量M和分配系数m 1st 在GFC分级范围内m与M关系 此时，分离度方程为 方程示：b值越大，即凝胶分级范围越小，Rs越大。 2nd 因此，一定料液时，根据组分的M选择分级范围较小的介质，提高Rs和料液的处理量。;凝胶的粒径 1st dp?, HETP?.故dp?是N?的最佳途径； 2nd dp?