实验一底物浓度对酶促反应的影响.docxVIP

实验一底物浓度对酶促反应的影响 实验一底物浓度对酶促反应的影响 PAGE 实验一底物浓度对酶促反应的影响 实验一 底物浓度对酶促反应的影响 实验目的 掌握底物浓度对酶活性的影响，了解碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, AKP）的Km值的测定原理和方法，理解Km值的意义。 二、实验原理 在温度、pH及酶浓度等恒定的条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。当底物浓度较低时，酶促反应速度V随底物浓度[S]的增高而显著加快，随着底物浓度渐高，反应速度加快程度渐小，当底物浓度增加到一定程度以上时，再增高底物浓度，反应速度亦不再增加，成为该条件下极限最大反应速度Vmax。底物浓度与反应速度的这种关系可以用下列米－曼（Michaclis-Menten）氏方程式表示。 V=或Km=[S]( — 1) 式中，Km为米氏常数。当V=Vmax/2时，则Km=[S]，即米氏常数是反应速度等于最大速度一半时底物物浓度的数值。如图所示： [V] Vmax Km [S] 图1 底物浓度与酶促反应速度的关系 Km是酶的特征性常数，不同酶的Km值不同，同一酶作用于不同底物的Km值亦不同。大多数纯酶的Km值在～100mmol/L之间。Km值的测定在酶学研究中有重要的实际意义。 根据实验结果绘制上述直角双曲线，难以准确求出Km和Vmax值。而用米曼氏方程式的下列变换式，则容易求得Km及Vmax值。 米曼氏方程式中各项皆采用倒数表示，则成为Lineweaver—Burk氏方程式： =·+ 如图所示： 斜率= 图2 Lineweaver—Burk氏法作图求Km值 这是个上截式直线方程式。与为直线关系，如上图。直线斜率为，纵轴截距为，横轴截距为－.据此可以测定不同浓度底物的反应速度，按与关系作图而容易正确得出Km值。 另有其他变换式，例如把上式两侧皆乘以[S]，则转换成Wilkinson氏方程式。 =+·[S] 如图所示： 斜率= -K m [S] 图3 Wilkinson氏法作图求Km值 这也是直线方程式。以为纵轴，[S]为横轴作图，则直线在横轴上的截距为－Km. 本实验利用磷酸苯二钠法测定不同浓度底物的碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, AKP）的反应速度，作图求出Km值。 AKP的催化原理为：在一定pH和温度下，待测液中的AKP作用于基质液中的磷酸苯二钠，使之水解释放出酚。酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林(AAP)作用并经铁氰化钾氧化，生成红色醌类化合物。以酚作标准液同样处理显色进行比色，可测知酚的生成量，从而计算出酶的活力。 三、实验器材 试管、37℃水浴锅、可见分光光度计、座标纸。 四、实验试剂 1、L基质液 称取磷酸苯二钠 2H2O ，用煮沸冷却的蒸馏水溶解并稀释至1000mL。加4mL氯仿防腐贮于棕色瓶中冰箱保存，可用一周。 2、L pH10碳酸盐缓冲液（含% 4-氨基安替比林） 称取4-氨基安替比林（AAP）3g，用L pH10碳酸盐缓冲液溶解并稀释至1000mL，放棕色瓶内，冰箱保存。 3、酚标准液（1mg/mL）与酚标准应用液（mL） = 1 \* GB3 ①酚标准液（1mg/mL）：称取结晶酚克溶于盐酸至1000mL。 ②酚标准应用液（mL）：准确吸取酚标准贮存液（1mg/1mL） mL于100mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，贮存冰箱中可保存一个月。 4、％铁氰化钾溶液 称取5g铁氰化钾和15g硼酸，分别溶于400mL蒸馏水中，溶解后两液混合，再加蒸馏水至1000mL，置于棕色瓶中暗处保存。 5、L pH10碳酸盐缓冲液(37℃时 称取无水碳酸钠及碳酸氢钠溶解于蒸馏水中，稀释至1000mL。 6、L Tris缓冲液 称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)，用蒸馏水溶解并稀释到1000mL，此即为L Tris溶液。取上液100mL，加蒸馏水约700mL，再加L醋酸钠100mL，混匀后用１%醋酸调pH到，用蒸馏水稀释至1000mL。 7、酶液 AKP（10mg，10U/mg）用L Tris缓冲液稀释成每mL含—单位的酶溶液。 五、实验操作 取干净试管8支，编号，按下表操作。特别注意准确吸取酶液、基质液及标准液。 管 号 1 2 3 4 5 6