实验三-微生物检定法测定硫酸庆大霉素的效价.docxVIP

实验三-微生物检定法测定硫酸庆大霉素的效价 实验三-微生物检定法测定硫酸庆大霉素的效价 PAGE 0 PAGEPAGE 10 实验三-微生物检定法测定硫酸庆大霉素的效价 实验三 微生物检定法测定硫酸庆大霉素的效价 一、概述 由于抗生素多为结构复杂的多组分物质，异构体多，且不稳定，容易产生降解杂质，故各国药典均以微生物检定法为主要含量测定法，因为抗生素药品的医疗作用主要是它的抗菌活力，而微生物检定法正是以抗生素的抗菌活力为指标来衡量抗生素效价的一种方法，其测定原理与临床要求相一致，能直接反映抗生素医疗价值，因此一直为各国药典所采用的主要测定方法。 微生物检定法测定抗生素效价，一般可分为稀释法、比浊法和琼脂扩散法三类。以琼脂扩散法应用最广泛，为目前国际上测定抗生素效价的通用方法。 琼脂扩散法，亦称管碟法。系采用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，采用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。 二、基本设备、用具和试验材料 1. 基本设备 (1) 抗生素效价测定实验室：室内应为半无菌，装有紫外线灯，有固定的效价测定台，台面要求水平、防震。该室应与稀释抗生素溶液的工作室隔离，以防止空气、地面污染抗生素。 (2) 超净工作台：超净工作台应放置在洁净工作室或半无菌室内。 (3) 抑菌圈面积测量分析仪：该仪器装有微处理机，可自动测量抑菌圈面积，并打印出统计分析的各种数据。 2.用具 （1） 玻璃双碟：为硬质玻璃制品，碟底内径约90mm，碟高16-17mm，碟底面应平，厚薄均匀无凹凸现象。新购的双碟应按上述要求进行检查。检查时可将双碟底平放在水平台上，每碟内加入2ml染料液，仔细观察碟底反映的颜色深浅是否一致，挑选底部平的双碟，洗净晾干，置高温烘箱内140-160℃干热灭菌2小时后备用。 (2) 陶瓦圆盖：应平，无凹凸现象。 (3) 不锈钢小管：外径±，内径±，高±，重量差异不超过±25mg，钢管内外壁要求光洁，管壁厚薄要一致，两端面要平坦光洁。 (4) 小钢管放置器：四孔，一台。 (5) 游标卡尺：精密度。 (6) 滴管：管口应细长平滑，不得有缺口。 3. 试验材料 (1) 培养基I：取胨5g、牛肉浸出粉3g、磷酸氢二钾3g和蒸馏水1000ml，加热融化，混合，调节pH使其值比最终的pH值略高，加入琼脂20g，加热溶化过后，调节pH值使灭菌后为，在115℃灭菌30分钟。 (2) 营养琼脂培养基：取胨10g、氯化钠5g和肉浸液1000ml，混合，调节pH使比最终的pH值略高，加入琼脂15-20g，加热溶化过后，调节pH值使灭菌后为，分装，在115℃灭菌30分钟，趁热斜放使凝固成斜面。 (3) 磷酸盐缓冲液（）：取磷酸氢二钾与磷酸二氢钾，加蒸馏水使成1000ml，在115℃灭菌30分钟。 (4) 试验用菌种：短小芽孢杆菌(CMCC(B)63 202). 短小芽孢杆菌菌悬液的制备和保存：取短小芽孢杆菌试验用菌种斜面1支，按无菌操作要求加入灭菌水2ml，将菌苔洗下，摇匀，取出1ml接种于盛有30ml营养琼脂培养基的100ml 三角瓶中，在35-37℃培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上，用灭菌水20ml将芽孢洗下，制成悬液，在65℃水浴中加热30分钟，即得，置5℃冰箱中保存，可使用6个月。 4. 双碟的制备：取直径约90mm、高16-17mm的平底双碟，分别注入加热融化的培养基I 20ml,使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层。另取培养基适量加热融化后，放冷至50-60℃，加入菌悬液适量（能得清晰的抑菌圈为度）,摇匀，在每1双碟中分别加入5ml，使在底层上均匀摊布，作为菌层。放置水平台上冷却后，在每1双碟中以等距离均匀安置不锈钢小管（内径±，高±，外径±）4个，用陶瓦圆盖覆盖备用。 三、二剂量检定法 取照上述方法制备的双碟不得少于4个，在每1双碟中对角的2个不锈钢小管中分别滴装高浓度及低浓度的标准品溶液，其余2个小管中分别滴装相应的高低两种浓度的供试品溶液；高、低浓度的剂距为2：1或4：1。在35-37℃条件下培养14-16小时后，测量各个抑菌圈的直径（或面积），照生物检定统计法中的法进行可靠性测验及效价计算。 四、硫酸庆大霉素的效价测定： 1. 标准品溶液的配制：精密称取硫酸庆大霉素标准品适量，加乙醇溶解后，用灭菌水制成每1ml中含1000单位的溶液，作为贮备液，置5℃以下的冰箱中保存，可使用7日。将贮备液加磷酸盐缓冲液稀释，使标准品高剂量溶液和低剂量溶液每ml中分别含硫酸庆大霉素10U和5U。 2. 供试品溶液的配制：取硫酸庆大霉素肠溶片4片，研细，用乙醇适量（硫酸庆大霉素约，用乙醇25ml），分次研磨使硫酸庆大霉素溶解，并用